董世桃，楊智敏，張明哲，楊名慧，王文華

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，遵義 563003)

近幾年，隨著社會(huì)、工作壓力逐漸增大，加之環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)峻，男性不育的發(fā)生率一直居高不下，尤其以無(wú)精子癥為常見(jiàn)病因[1]。精子的產(chǎn)生是一個(gè)涉及多因素、多階段的過(guò)程，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙都會(huì)引起精子生成異常，無(wú)精子癥一般分為梗阻性和非梗阻性兩種，其中60%以上的患者為非梗阻性，是由于遺傳因素、內(nèi)分泌紊亂等導(dǎo)致睪丸生精功能障礙[2]。近些年，隨著生殖醫(yī)學(xué)的深入發(fā)展，大多數(shù)梗阻性患者通過(guò)睪丸取精術(shù)都可以受精成功，但是對(duì)于非梗阻性患者，目前臨床上尚缺乏有效的治療手段，經(jīng)睪丸取精后受精成功率不到30%[3]。非梗阻性無(wú)精子癥的發(fā)病因素復(fù)雜且多樣化，臨床大多采用經(jīng)驗(yàn)式治療，因此探索精子的發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床價(jià)值。近幾年，大量研究發(fā)現(xiàn)，磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)在睪丸組織中呈高表達(dá)，與X染色體的失活密切相關(guān)[4]。但是尚沒(méi)有研究證實(shí)PRPS2對(duì)精子發(fā)生的影響作用，因此我們基于上述理論，首先探討PRPS2在生精功能不良的睪丸組織中的表達(dá)情況，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究PRPS2影響精子生成的作用機(jī)制，從而為尋找非梗阻性無(wú)精子癥的候選診斷分子提供理論支持。

資料與方法

一、研究對(duì)象

1.臨床資料：本項(xiàng)研究收集2015年7至2017年6月期間在我院病理科存檔的石蠟包埋睪丸組織標(biāo)本63例，納入研究前由本院專業(yè)的病理科醫(yī)師對(duì)組織切片進(jìn)行復(fù)檢，確定是睪丸組織標(biāo)本，其中45例標(biāo)本來(lái)自無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥患者，18例組織標(biāo)本取自生精功能正常者，患者年齡為23～46歲，平均年齡為(30.15±4.46)歲。17例患者為輕度生精功能不良，14例患者為重度生精功能不良，14例患者為唯支持細(xì)胞綜合征。本項(xiàng)研究獲得遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并詳細(xì)告知睪丸組織來(lái)源病例或病例家屬其組織切片的用途，且確保病例資料不外泄。

2.受試細(xì)胞：小鼠精原細(xì)胞株GC1、小鼠精母細(xì)胞株GC2、小鼠支持細(xì)胞株TM4購(gòu)自American Type Culture Collection公司。

二、實(shí)驗(yàn)試劑與方法

1.主要試劑：FBS胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó))；噻唑蘭(MTT)(Sigma，美國(guó))；鼠單克隆PRPS2抗體(Abnova，美國(guó))、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG二抗(Abnova，美國(guó))；S-P免疫組化試劑盒(中杉金橋，北京)；Trizol試劑、LipofectamineTM 2000、Opti-MEM(Invitrogen，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Mix(Takara Bio，日本)；cDNA合成試劑盒(OMEGA，美國(guó))；細(xì)胞凋亡試劑盒(OMEGA，美國(guó))。PCR引物以及siRNA干擾靶序列來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并委托上海生工生物工程有限公司合成。

2.主要儀器：HERcell150i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國(guó))；Eppendorf 5427 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；實(shí)時(shí)定量PCR儀，iMake多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))；Amersham電泳儀(Bioscience，瑞典)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，美國(guó))。

3.免疫組化：按照病理編號(hào)調(diào)出我院病理科存檔石蠟包埋組織切片，脫蠟水化后，切片(1～2 μm)，置于載玻片上，烘干48 h后待用；抗原熱修復(fù)；滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；封閉；加入PRPS2(1∶150稀釋)一抗孵育；加入二抗孵育；滴加DAB試劑顯色；蘇木精復(fù)染。隨機(jī)選擇10個(gè)視野，置于倒置顯微鏡下，PRPS2呈胞核棕黃色染色。分別對(duì)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比進(jìn)行客觀評(píng)分：0分(陰性)，1分(弱染色)，2分(中度染色)，3分(強(qiáng)染色)。陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比：0分(0)，1分(≤25%)，2分(25%～≤50%)，3分(50%～≤75%)，4分(>75%)。染色指數(shù)(LI)=陽(yáng)性細(xì)胞率×染色強(qiáng)度，LI<6分為低表達(dá)，LI≥6分為高表達(dá)。

4.構(gòu)建PRPS2質(zhì)粒以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)：基因沉默或過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株：構(gòu)建pGMLV-GFP RNAi慢病毒重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。根據(jù)質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。穩(wěn)轉(zhuǎn)前1 d接種細(xì)胞至6孔板中。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，在3個(gè)2 μl EP管中分別加入5 μl PRPS2、PRPS2 shRNA或?qū)φ杖芤海约?50 μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)操作；將脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA 復(fù)合液滴加至孔板細(xì)胞表面，培養(yǎng)24～48 h后，提取細(xì)胞RNA，驗(yàn)證目的基因表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)嘌呤霉素篩選PRPS2基因沉默或過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS和青霉素-鏈霉素雙抗體的完全DMEM培養(yǎng)基中，將細(xì)胞置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h更換培養(yǎng)液，48 h(或待細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí))傳代一次。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集5×105個(gè)/ml細(xì)胞，洗滌3次后，加入500 μl Binding Buffer重懸，分別加入Annexin V 5 μl，避光孵育15 min，PE 5 μl避光孵育15 min；3 000 r/min離心5 min(離心半徑8 cm)，棄上清；加入300 μl結(jié)合緩沖液；采用流式細(xì)胞儀(EX=488 nm，Em=530 nm)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

6.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將各組細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)單層接種至96孔板中，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，加入20 μl MTT，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入200 μl/孔 DMSO，充分溶解紫色結(jié)晶物。置于iMake多功能酶標(biāo)儀上，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處的吸光光度值(OD450 nm值)，計(jì)算平均值。

7.實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)法：收集饑餓處理24 h后的細(xì)胞1×1010個(gè)，加入1 ml預(yù)冷的Trizol，充分裂解5～10 min；按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總RNA；將RNA充分干燥后加入20 μl DEPC水溶解，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以細(xì)胞cDNA為模板，以β-actin作為內(nèi)參，制備20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。

8.Western blot：提取蛋白樣品，分裝保存至-80℃?zhèn)溆?；采用BCA法定量測(cè)定蛋白濃度；按照1∶1體積比加入2×SDS蛋白電泳緩沖液，置于100℃沸水中5 min，使蛋白充分變性；自然冷卻后，置于-20℃?zhèn)溆?。進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入PRPS2一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過(guò)夜；采用PBST沖洗3次后，加入二抗(按照1∶5 000采用5% PBST牛奶稀釋)，室溫孵育1 h；顯影；采用FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析，以積分光密度(IOD)表示灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同睪丸組織中PRPS2的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，生精功能正常的睪丸組織中PRPS2高表達(dá)率為72.22%，顯著高于重度生精功能不良的睪丸組織以及唯支持細(xì)胞綜合征睪丸組織(P<0.05)；其中唯支持細(xì)胞綜合征睪丸組織中PRPS2高表達(dá)率最低，顯著低于輕度生精功能不良睪丸組織中PRPS2高表達(dá)率(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 不同類型睪丸組織中PRPS2的表達(dá)情況 [n(%)]

注：與生精功能正常組相比較，aP<0.05；與輕度生精不良組相比較，bP<0.05

A：低表達(dá)；B：高表達(dá)；Scale bar=20 μm圖1 免疫組化檢測(cè)PRPS2在睪丸組織中的定位情況 ×400

二、PRPS2在GC1、GC2和TM4細(xì)胞株中的表達(dá)及定位

qRT-PCR結(jié)果顯示，GC1細(xì)胞株中PRPS2表達(dá)量顯著高于GC2和TM4細(xì)胞株(P<0.05)。經(jīng)免疫熒光染色法檢測(cè)，PRPS2主要定位于細(xì)胞核中，與睪丸組織免疫組織化學(xué)結(jié)果基本一致(圖2，圖3)。

三、PRPS2對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞shPRPS2基因沉默后，與空白對(duì)照組(NC組)比較，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。而PRPS2基因表達(dá)上調(diào)后，GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組和shPRPS2組顯著降低(P<0.05)(圖4)。

與GC1細(xì)胞比較，aP<0.05圖2 qRT-PCR法檢測(cè)PRPS2在GC1、GC2和TM4細(xì)胞株中的表達(dá)情況

藍(lán)色為DAPI染色，綠色為PRPS2陽(yáng)性信號(hào)圖3 免疫熒光染色法檢測(cè)PRPS2在GC1、GC2和TM4細(xì)胞株中的定位情況 ×400

四、PRPS2對(duì)生精細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)MTT法檢測(cè)，GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞shPRPS2基因沉默后，與空白對(duì)照組(NC組)比較，細(xì)胞增殖活性顯著增加(P<0.05)。而PRPS2基因表達(dá)上調(diào)后，GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組和shPRPS2細(xì)胞組顯著降低(P<0.05)(圖5)。

與NC組比較，aP<0.05；與轉(zhuǎn)染shPRPS2組比較，bP<0.05圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PRPS2對(duì)GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞凋亡的影響

與NC組比較，aP<0.05；與轉(zhuǎn)染shPRPS2組比較，bP<0.05圖5 MTT法檢測(cè)PRPS2對(duì)GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞增殖的影響

五、PRPS2對(duì)下游靶基因E2F1的調(diào)控

通過(guò)qRT-PCR法和Western blot法證實(shí)，GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞shPRPS2基因沉默后，與空白對(duì)照組(NC組)比較，E2F1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。而PRPS2基因表達(dá)上調(diào)后，GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞E2F1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組和shPRPS2細(xì)胞組顯著上調(diào)(P<0.05)(圖6)。

與NC組比較，aP<0.05；與轉(zhuǎn)染shPRPS2組比較，bP<0.05圖6 qRT-PCR方法和Western blot方法檢測(cè)GC1、GC2和TM4細(xì)胞中E2F1的表達(dá)

討 論

男性不育一直是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最棘手的難題之一，并且近幾年出現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。男性不育的發(fā)生原因復(fù)雜且多樣化，包括遺傳因素、內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素、精索靜脈曲張、生精管道阻塞等，但是無(wú)論何種因素，最終都會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量或活力下降。精子的生成極其復(fù)雜，涉及多階段、多基因、多通路的共同參與。目前對(duì)于無(wú)精子癥和重度少精子癥患者，臨床一般通過(guò)睪丸取精的方式獲取精子，并注射至卵泡漿中進(jìn)行受精[6]。近幾年，隨著生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，睪丸取精的成功率已經(jīng)大大提高，尤其是對(duì)于梗阻性無(wú)精子癥患者，受精成功率可達(dá)70%以上；但是對(duì)于非梗阻性無(wú)精子癥患者，目前臨床治療一直不理想，通過(guò)睪丸取精進(jìn)行受精的成功率尚不到30%[3]，因此，尋找精子生成的相關(guān)基因和通路是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域長(zhǎng)期探討的難題和熱點(diǎn)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于睪丸組織蛋白組學(xué)和基因組學(xué)的研究較少[7]，而且發(fā)現(xiàn)的大部分基因都是針對(duì)正常精子的生成過(guò)程[8]，與男性不育密切相關(guān)的基因和蛋白并不多見(jiàn)。在前期研究中，我們通過(guò)高通量基因芯片技術(shù)篩選了與生精功能障礙密切相關(guān)的基因，其中生精功能嚴(yán)重障礙者精原細(xì)胞中PRPS2基因的表達(dá)量明顯降低，本研究試圖通過(guò)本項(xiàng)研究探討PRPS2與精子發(fā)生的關(guān)系。

PRPS2是近幾年重新關(guān)注的具有焦磷酸合酶活性的多糖基化蛋白，屬于PRPP家族成員之一，通過(guò)調(diào)控嘌呤和嘧啶核苷的代謝，參與X染色體的失活[9]。本研究首先通過(guò)免疫組化方式顯示PRPS2與睪丸生精功能的關(guān)系，結(jié)果表明，在生精功能障礙者的睪丸組織中，PRPS2高表達(dá)率明顯低于生精功能正常者(P<0.05)，并且主要定位于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，而在精子細(xì)胞核成熟精子中并未見(jiàn)明顯的PRPS2陽(yáng)性表達(dá)。提示PRPS2可能參與正常精子的生成過(guò)程，并且與睪丸生精功能障礙嚴(yán)重程度可能呈負(fù)相關(guān)性。雖然初步研究得到了較為理想的結(jié)論，但是究竟是因?yàn)镻RPS2基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致精子生成障礙，還是其他因素引起睪丸生精功能不良導(dǎo)致PRPS2蛋白分泌量降低，目前尚未見(jiàn)直接的證據(jù)支持，尚需進(jìn)一步從細(xì)胞學(xué)角度探討PRPS2與精子生成的關(guān)系。

目前，大量研究證實(shí)，睪丸生精功能障礙與精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和支持細(xì)胞的凋亡、增殖失衡有關(guān)[10]。正常男性精液中，精子凋亡率極低，生理?xiàng)l件下精子的凋亡只是消除過(guò)量或異常的生精細(xì)胞，以維持精子數(shù)量和活力在正常范圍[8]。而在不育男性精液中，精子數(shù)量明顯降低，甚至在高倍鏡下觀察不到精子的存在[11]，因此筆者探討PRPS2與睪丸生精功能的關(guān)系，首先從影響生精細(xì)胞增殖和凋亡著手，進(jìn)一步分析PRPS2基因的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，PRPS2基因敲除后，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和支持細(xì)胞凋亡率均明顯增加，增殖活性受到明顯抑制，而PRPS2基因過(guò)表達(dá)后，生精細(xì)胞的凋亡和增殖活性恰好相反，從而證實(shí)PRPS參與調(diào)控生精細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。另外，由于目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于PRPS2研究尚少，僅有的一些研究也只是停留在對(duì)嘌呤及嘧啶核苷酸代謝的影響方面[12]，尚未見(jiàn)關(guān)于下游調(diào)控通路或蛋白的研究。既往，國(guó)外有研究顯示，E2F1與精子生成密切相關(guān)[5]。而且雷斌等[13]通過(guò)高通量基因芯片篩選技術(shù)，認(rèn)為E2F1可能是PRPS2下游靶基因。因此本研究通過(guò)qRT-PCR法和Western blot法初步證實(shí)了PRPS2對(duì)E2F1的調(diào)控影響，結(jié)果顯示，GC1細(xì)胞、GC2細(xì)胞和TM4細(xì)胞shPRPS2基因沉默后，E2F1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，而PRPS2基因表達(dá)上調(diào)后，生精細(xì)胞E2F1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，提示PRPS2在轉(zhuǎn)錄水平可以直接調(diào)控E2F1的表達(dá)，進(jìn)而影響生精細(xì)胞的凋亡及增殖。既往國(guó)外有研究已經(jīng)證實(shí)E2F1基因缺失與睪丸生精功能障礙密切相關(guān)，通過(guò)影響生精細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，導(dǎo)致精原細(xì)胞增殖活性受到抑制，進(jìn)而影響各級(jí)精子細(xì)胞的數(shù)量，最終導(dǎo)致無(wú)精子癥或少精癥[14]。

綜上所述，睪丸組織PRPS2蛋白表達(dá)與小鼠精原細(xì)胞株GC1、小鼠精母細(xì)胞株GC2、小鼠支持細(xì)胞株TM4的凋亡和增殖有關(guān)，可能通過(guò)調(diào)控下游E2F1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制生精細(xì)胞的增殖，促使其凋亡，最終導(dǎo)致無(wú)精子癥或重度少精癥的發(fā)生。但是由于實(shí)際臨床中，睪丸組織樣本獲取難度較大，加上PRPS2生物學(xué)機(jī)制研究過(guò)于簡(jiǎn)單，但是無(wú)論如何，本項(xiàng)研究仍然為男子非阻塞性無(wú)精子癥的診斷以及發(fā)病機(jī)制的探索提供了新的方向和理論基礎(chǔ)。