邵 娟王曉東 馬 欣 成少寧 許先猛

（運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院，山西運(yùn)城 044000）

耐酸耐熱菌是一類耐酸、耐熱、嚴(yán)格需氧、無致病性的桿狀細(xì)菌，生長pH范圍為2.0～6.0，生長溫度范圍為20℃～70℃，因其細(xì)胞模中含有特殊的W-環(huán)狀脂肪酸，常規(guī)巴氏殺菌不能將其殺滅，反而起一個(gè)熱沖擊的作用，刺激耐酸耐熱菌芽孢的形成和生長。耐酸耐熱菌中的酸土脂環(huán)芽孢桿菌和酸熱脂環(huán)芽孢桿菌等可以代謝產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)——愈創(chuàng)木酚和鹵酚，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗，給企業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

目前國內(nèi)外的研究主要集中在對(duì)耐酸耐熱菌的檢驗(yàn)、鑒定、水果表面清洗及果汁中該菌的控制方面，其中大多處于實(shí)驗(yàn)室階段，而在果汁實(shí)際生產(chǎn)中管道會(huì)被耐酸耐熱菌污染，由于設(shè)備中管道復(fù)雜，死角較多，若消毒不徹底，會(huì)引起交叉污染。PODOLAK等將接種有耐酸耐熱菌芽孢的蘋果汁涂抹在不銹鋼表面上，晾干并用無菌水處理后用不同消毒劑進(jìn)行消毒，雖然該試驗(yàn)接近于實(shí)際生產(chǎn)，但由于不銹鋼表面比較粗糙，不能準(zhǔn)確反映消毒的效果。余清等用消毒劑對(duì)設(shè)備中的管路進(jìn)行消毒，取得了良好的效果，但并沒有對(duì)不同的消毒劑殺菌效果進(jìn)行比較。ORR等研究了5種消毒劑對(duì)濃度為107CFU/mL的耐酸耐熱菌芽孢的消毒效果，由于管道設(shè)備經(jīng)過沖洗后，殘留的耐酸耐熱菌數(shù)量較少，該試驗(yàn)中消毒劑使用濃度并不適用于管道消毒。本文通過對(duì)3種不同品牌消毒劑對(duì)耐酸耐熱菌的殺滅效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以找出殺滅耐酸耐熱菌的較好的消毒劑，旨在為生產(chǎn)車間中的設(shè)備消毒、耐酸耐熱菌的防治提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

YSG培養(yǎng)基：酵母粉（MERCK）；葡萄糖，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉（MERCK）；瓊脂 （MERCK）。

消毒劑：消毒劑A（過氧乙酸15%,過氧化氫＜23%）；消毒劑B（過氧乙酸16.3%，過氧化氫22.6%）；季銨鹽類消毒劑C（六亞甲基四胺27%～33%+季銨鹽 10%～12%)。

中和劑：胰蛋白胨，北京路橋技術(shù)股份有限公司；硫代硫酸鈉，廣東汕頭市西隴化工廠；吐溫，成都科龍化工試劑廠；卵磷脂，天津市博迪化工有限公司；氯化鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈣，廣東汕頭市西隴化工廠；氯化鎂，廣東汕頭市西隴化工廠。

中和劑：0.5%硫代硫酸鈉+0.5%吐溫+0.3%卵磷脂的TPS為季銨鹽類消毒劑的中和劑；1%硫代硫酸鈉為過氧乙酸和過氧乙酸與過氧化氫復(fù)合消毒劑的中和劑。

菌種：耐酸耐熱菌陽性菌種，陜西海升發(fā)展股份有限公司運(yùn)城分公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-16無菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PYX-DHS-40X50-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；HPD-25真空泵；PHS-3C精密酸度計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司；CP224S分析天平，北京賽多利斯儀器公司；HY-4多功能震蕩器，金壇富華；0.45 μm微孔濾膜。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 增菌及菌液濃度的確定

將斜面培養(yǎng)的純耐酸耐熱菌接種至滅菌的濃縮果汁中，45℃下培養(yǎng)5 d，吸取1 mL菌液稀釋至不同濃度，每一稀釋度接種3個(gè)平皿進(jìn)行培養(yǎng)，選取菌落數(shù)在15 CFU～300 CFU的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，3個(gè)平板的菌落平均值乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。

1.3.2 中和劑鑒定試驗(yàn)

依據(jù)衛(wèi)生部頒布的《消毒技術(shù)規(guī)范》2002版，首先需要評(píng)價(jià)中和劑、消毒劑及中和產(chǎn)物對(duì)耐酸耐熱菌生長狀況的影響，試驗(yàn)共分為6組，第1組：消毒劑+菌懸液→培養(yǎng)；第2組：（消毒劑+菌懸液）+中和劑→培養(yǎng)；第3組：中和劑+菌懸液→培養(yǎng)；第4組：（消毒劑+中和劑） +菌液→培養(yǎng)；第5組：稀釋液+菌懸液→培養(yǎng)；第6組：稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基→培養(yǎng)；然后按照中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序進(jìn)行操作。

1.3.3 懸液定量殺菌試驗(yàn)

果汁廠管道經(jīng)過清洗后，消毒前的漂洗水中耐酸耐熱菌的濃度較小，并根據(jù)消毒劑說明書上推薦的稀釋濃度和消毒時(shí)間，用無菌硬水將不同消毒劑稀釋至質(zhì)量濃度為0.1%、0.2%、0.25%，消毒時(shí)間定為10 min，在20℃條件下進(jìn)行試驗(yàn)。先加入1 mL試驗(yàn)用菌懸液，混勻，置20℃±1℃水浴中5 min后，用無菌吸管吸取上述質(zhì)量濃度消毒液9 mL注入其中，迅速混勻并立即記時(shí)10 min。各管試驗(yàn)菌與消毒劑混合液經(jīng)加90 mL中和劑作用10 min后，測定存活菌數(shù)。每管樣液接種2個(gè)平皿，同時(shí)用稀釋液代替消毒液，進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽性對(duì)照。所有試驗(yàn)樣本均通過抽濾后，按照耐酸耐熱菌的檢測方法，在45℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，觀察最終結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)3次求平均值，并計(jì)算殺滅率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液濃度的確定

由于漂洗水中耐酸耐熱菌濃度較小，為了與生產(chǎn)實(shí)際相符，并節(jié)約成本，消毒試驗(yàn)的耐酸耐熱菌通過稀釋后的菌液濃度為1.0×103CFU/mL。

2.2 中和劑試驗(yàn)結(jié)果

過氧乙酸和過氧乙酸與過氧化氫復(fù)合消毒劑的中和劑試驗(yàn)中所加菌液的濃度為1.0×103CFU/mL，通過預(yù)試驗(yàn)可知當(dāng)所加菌液的濃度為1.0×103CFU/mL時(shí)，季銨鹽類消毒劑第一組還有大量菌生長。章迎春等通過降低消毒劑濃度解決了因消毒劑指示濃度過高而造成的中和劑判定困難的問題，本文因消毒劑濃度較低而使消毒劑的中和劑判定困難，因此調(diào)整季銨鹽類消毒劑的中和劑試驗(yàn)中所加菌液的濃度為1.0×102CFU/mL，結(jié)果見表1，以下數(shù)據(jù)為3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值。根據(jù)中和劑判定標(biāo)準(zhǔn)，選定0.25%作為中和劑試驗(yàn)的消毒劑濃度。

表1 消毒劑A、B、C的中和劑選擇試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，消毒劑的中和劑試驗(yàn)中，第3、4、5組菌數(shù)相近，其誤差率≤10%；第6組無菌生長；第2組菌明顯少于3、4、5組；第1組不長菌或明顯少于第2組，結(jié)果表明中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)耐熱耐酸菌的生長均無顯著影響，因此判定1%的硫代硫酸鈉為過氧乙酸和過氧乙酸與過氧化氫復(fù)合消毒劑的中和劑；0.5%硫代硫酸鈉+0.5%吐溫+0.3%卵磷脂的TPS為季銨鹽類消毒劑的中和劑，這些成分可以很好的中和殘留的消毒劑，保證消毒時(shí)間的準(zhǔn)確性。

2.3 不同濃度消毒劑殺菌情況

不同濃度消毒劑殺菌情況分別見表2、表3。

由表3可知，當(dāng)消毒劑質(zhì)量濃度分別為0.1%、0.2%、0.25%時(shí)，同一種消毒劑隨著消毒劑濃度的增加，消毒效果明顯增強(qiáng)，殺滅率呈上升趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1%、0.2%時(shí)，消毒劑A的消毒效果要好于消毒劑B，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.25%時(shí)，消毒劑A和消毒劑B對(duì)耐酸耐熱菌都達(dá)到完全殺滅，但季銨鹽的殺滅率較小，僅為82.9%。

表2 不同濃度消毒劑殺菌試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

表3 不同濃度消毒劑殺滅率結(jié)果報(bào)告

3 討論

3.1 中和劑試驗(yàn)

消毒劑與微生物作用到達(dá)規(guī)定時(shí)間的終點(diǎn)時(shí)，分別加入適宜種類和濃度的中和劑，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生物，過氧乙酸與過氧化氫復(fù)合消毒劑的主要成分具有氧化作用，因此選用具有還原作用的硫代硫酸鈉作為這些消毒劑的中和劑。季銨鹽類消毒劑主要成分為醛類衍伸物和季銨鹽，其中和劑的主要成分為硫代硫酸鈉，由于市售季銨鹽消毒劑多為復(fù)合型，即含相關(guān)活性物質(zhì)和表面活性劑以提高殺菌效果和保持穩(wěn)定性，在對(duì)其殘余殺菌力進(jìn)行清除時(shí)應(yīng)同時(shí)中和其活性物質(zhì)，這樣才能避免錯(cuò)誤的判斷，因此季銨鹽類消毒劑的中和劑中加入了卵磷脂、吐溫-80以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 消毒試驗(yàn)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，消毒劑在稀釋濃度分別為0.1%、0.2%、0.25%，消毒時(shí)間為10 min時(shí)，過氧化物類消毒劑消毒效果要好于季銨鹽類。季銨鹽消毒劑消毒機(jī)理為破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，菌體物質(zhì)外滲，使蛋白質(zhì)和酶變性，抑制酶系統(tǒng)，影響細(xì)胞代謝，對(duì)部分微生物殺滅效果不好，如分枝桿菌、腸道病毒等。過氧化物類消毒劑具有強(qiáng)氧化性，不僅能破壞微生物的通透性屏障，使內(nèi)容物流出，與酶、氨基酸等發(fā)生反應(yīng)，而且能進(jìn)入菌體后作用于DNA的磷酸二酯鍵使DNA斷裂，并分解組成DNA的4種堿基，阻礙DNA的合成，可以快速殺滅細(xì)菌繁殖體、真菌、病毒、分枝桿菌、細(xì)菌芽孢等。與季銨鹽類消毒劑相比，過氧化物類消毒劑更多的從基因?qū)用鎸?duì)菌體進(jìn)行破壞，這與鄭吟秋、洪令瑤等的研究相符。在試驗(yàn)中當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1%和0.2%時(shí)，消毒劑A的消毒效果要好于消毒劑B，但兩者所含有效成分及含量相似，這可能與消毒劑A中含有的其他附加物有關(guān)，在此濃度下，消毒劑A和消毒劑B對(duì)耐酸耐熱菌都沒有達(dá)到完全殺滅，因此在果汁管道中的耐酸耐熱菌的消毒方面建議使用質(zhì)量濃度為0.25%的消毒劑A或消毒劑B，此試驗(yàn)還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，在榨季對(duì)管道中耐酸耐熱菌的線上消毒將是下一步研究的重點(diǎn)。