曹艷，夏其樂(lè)，陳劍兵，單之初，陸勝民*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江 杭州 310021； 2.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312000)

細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是由微生物產(chǎn)生的一類(lèi)纖維素的統(tǒng)稱(chēng)，由葡萄糖分子以β-1，4-糖苷鍵聚合而成[1]，其區(qū)別于植物纖維的主要特點(diǎn)是具有高持水力、高結(jié)晶度、高彈性模量、良好的生物相容性和機(jī)械性能等特性[2-3]。由于BC不含熱量、咀嚼性好，目前主要用作食品配料(又稱(chēng)為納塔)添加在罐頭、果凍、冰淇淋、火腿腸等食品中[2, 4]。目前，生產(chǎn)BC的主要原料是自然發(fā)酵的椰子水，產(chǎn)量為10～12 g·L-1(干質(zhì)量)。但我國(guó)椰子年產(chǎn)量只占全世界的0.04%[5]，生產(chǎn)原料不足、生產(chǎn)成本較高制約了我國(guó)BC產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。此外，BC也可作為新型材料基質(zhì)用于醫(yī)藥、化工、造紙等領(lǐng)域[6]，使得BC需求量逐年增加，而國(guó)內(nèi)目前所消費(fèi)的BC幾乎全部靠進(jìn)口。

浸米水是黃酒釀造過(guò)程中的主要副產(chǎn)物之一。我國(guó)黃酒年產(chǎn)量200萬(wàn)t左右，而生產(chǎn)1 t黃酒一般會(huì)產(chǎn)生大約0.65 t浸米水，浸米水量大而集中。目前浸米水主要通過(guò)沉降處理、上清經(jīng)曝氣處理后排放[7-8]。在浸米過(guò)程中，稻米中的淀粉、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被浸出，大量乳酸菌和酵母菌在其中繁殖并分解這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得浸米水中含有豐富的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]。因此，浸米水如果能被合理利用，即可成為回收利用的資源，而如果被當(dāng)作廢物棄之就會(huì)嚴(yán)重污染環(huán)境，最終對(duì)黃酒產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生不利影響。

目前，利用其他原料代替椰子水生產(chǎn)BC的研究報(bào)道也越來(lái)越多，其中以含糖/氮量較高的農(nóng)副產(chǎn)品加工副產(chǎn)物居多[10-13]。而浸米水外觀與自然發(fā)酵的椰子水類(lèi)似，呈淺黃色或淺棕色，pH在2.0～4.0，聞起來(lái)有酸味，且都經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵，其中除了碳源、氮源、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有大量可以被木醋桿菌利用的有機(jī)酸和醇類(lèi)[9, 14]。王志國(guó)等[15-17]的研究結(jié)果表明，一些小分子有機(jī)酸和醇類(lèi)可促進(jìn)BC合成。因此，本研究以浸米水為原料，考察了添加不同有機(jī)酸和醇類(lèi)對(duì)BC產(chǎn)量的影響，確定了影響以浸米水為原料發(fā)酵BC的主要物質(zhì)因素，為促進(jìn)國(guó)內(nèi)BC產(chǎn)業(yè)發(fā)展和實(shí)現(xiàn)浸米水提質(zhì)增效提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

木醋桿菌Gluconacetobacterxylinus，購(gòu)于微生物菌種保藏中心，保存于-80 ℃冰箱；浸米水取自浙江塔牌紹興酒有限公司，浸米水經(jīng)沉降過(guò)濾后，上清液用于配制BC發(fā)酵培養(yǎng)基。

UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；WYA-Z自動(dòng)阿貝折射儀，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；雷磁PHS-25臺(tái)式pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；超低溫冰箱，三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

菌種活化培養(yǎng)基。葡萄糖10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，碳酸鈣5 g·L-1，瓊脂粉17 g·L-1，以蒸餾水補(bǔ)足1 L，pH值自然，121 ℃滅菌15 min，冷卻到50～55 ℃后，傾倒至培養(yǎng)皿中備用。

種子培養(yǎng)基。參考HS培養(yǎng)基[18]。蔗糖20 g·L-1，酵母浸提物5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.7 g·L-1，檸檬酸1.15 g·L-1，用蒸餾水補(bǔ)足1 L，pH值自然，115 ℃滅菌15 min。100 mL種子培養(yǎng)基裝于250 mL燒杯，30 ℃靜置培養(yǎng)3～4 d。

浸米水基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。蔗糖30 g·L-1，酵母浸提物5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，檸檬酸1 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3 g·L-1，F(xiàn)eSO40.05 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，以浸米水補(bǔ)足1 L，pH值自然，115 ℃滅菌15 min。120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基量裝于300 mL燒杯中，接種量3%～5%，30 ℃靜置培養(yǎng)10 d。接種前向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同種類(lèi)、濃度的有機(jī)酸和醇，考察其對(duì)BC產(chǎn)量的影響。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 pH值和可溶性固形物含量

pH值測(cè)定用雷磁PHS-25臺(tái)式pH計(jì)測(cè)定；可溶性固形物含量(°Brix)用WYA-Z自動(dòng)阿貝折射儀測(cè)定[19]。

1.3.2 菌體濃度

向不同發(fā)酵時(shí)期的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100 U·g-1纖維素酶，于45 ℃、100 r·min-1水浴加熱6 h，待BC完全水解后，于600 nm處測(cè)定BC水解液和培養(yǎng)基混合液的吸光度(D600)[20]。

1.3.3 BC產(chǎn)量

將發(fā)酵所得BC取出后，用水沖洗幾次，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)。再將膜浸泡于0.1 mol·L-1的NaOH溶液，80 ℃煮沸20 min，去除BC膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，然后用蒸餾水多次沖洗，直至用pH試紙輕壓膜測(cè)pH值為中性。105 ℃干燥至恒質(zhì)量，BC產(chǎn)量用單位體積培養(yǎng)基所得BC干質(zhì)量計(jì)(g·L-1)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

每個(gè)處理均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果所示數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Excel 2010和SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同有機(jī)酸和醇類(lèi)對(duì)BC發(fā)酵的影響

在浸米水基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5 g·L-1不同有機(jī)酸和醇條件下，BC產(chǎn)量如圖1所示。添加的有機(jī)酸和醇均是糖類(lèi)在微生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，因此，它們可直接作為碳源或通過(guò)糖異生途徑被木醋桿菌利用。從圖中可以看出，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油對(duì)BC合成有顯著促進(jìn)作用，且添加乳酸、乙酸或乙醇條件下BC產(chǎn)量大幅提高；蘋(píng)果酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸和酒石酸抑制BC合成；丙酮酸和山梨醇對(duì)BC合成基本沒(méi)有影響。由此可以看出，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油可作為以浸米水為原料發(fā)酵BC的增效因子。

A，對(duì)照；B，乳酸；C，乙酸；D，丙酮酸；E，蘋(píng)果酸；F，琥珀酸；G，α-酮戊二酸；H，草酰乙酸；I，酒石酸；J，乙醇；K，甘油；L，山梨醇。柱間無(wú)相同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)圖1 添加不同有機(jī)酸和醇對(duì)以浸米水為原料發(fā)酵生產(chǎn)BC的影響

選擇具有代表性的處理組(添加乳酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、乙醇和甘油)，考察其發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物含量和菌體濃度變化，如圖2所示。從圖中可以看出，添加丙酮酸條件下，菌體生長(zhǎng)和可溶性固形物含量下降趨勢(shì)均與對(duì)照相差不大，由此可看出，丙酮酸沒(méi)有對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝活性產(chǎn)生影響，最終BC產(chǎn)量也與對(duì)照相當(dāng)。添加乳酸、乙酸或乙醇條件下，最大菌體濃度和可溶性固形物含量下降速率均比對(duì)照顯著提高，且提高幅度較大。添加琥珀酸和甘油條件下，最大菌體濃度和可溶性固形物下降速率比對(duì)照略高，BC產(chǎn)量提高幅度雖然較小，但與對(duì)照相比仍有顯著升高。添加α-酮戊二酸條件下，最大菌體濃度和可溶性固形物下降速率均顯著低于對(duì)照，表明菌體生長(zhǎng)及其代謝活性受到抑制，導(dǎo)致BC合成量下降。

圖2 添加不同有機(jī)酸和醇對(duì)菌體濃度和可溶性固形物含量的影響

BC合成需要消耗大量能量，乳酸、乙酸和乙醇作為糖酵解途徑的代謝產(chǎn)物，它們可通過(guò)氧化生成丙酮酸，參與胞內(nèi)代謝并產(chǎn)生能量，較多的能量可以促進(jìn)BC的合成[16, 21-22]。琥珀酸作為三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，額外添加可保證TCA循環(huán)的持續(xù)正常運(yùn)行，使胞內(nèi)能量水平維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，有利于BC合成[23]。甘油可通過(guò)糖異生途徑生成丙酮酸，參與BC合成，且不生成葡萄糖酸，胞內(nèi)底物代謝大部分轉(zhuǎn)向BC合成[24]。此外，甘油還可作為菌體在逆境中的保護(hù)劑，有利于維持菌體較高的代謝活力，有利于BC合成。丙酮酸、α-酮戊二酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸和酒石酸是微生物代謝的中間產(chǎn)物，其胞內(nèi)含量可能已經(jīng)能夠維持正常代謝，額外添加反而會(huì)擾亂正常的胞內(nèi)代謝，進(jìn)而對(duì)木醋桿菌生長(zhǎng)和BC合成產(chǎn)生不利影響。綜上所述，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油可促進(jìn)菌體內(nèi)部能量代謝或維持較高的菌體活力，進(jìn)而促進(jìn)BC大量合成。

2.2 不同濃度增效因子對(duì)BC產(chǎn)量的影響

在浸米水基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同有機(jī)酸類(lèi)增效因子(乳酸、乙酸和琥珀酸)條件下，BC產(chǎn)量如圖3所示。從圖中可以看出，隨著有機(jī)酸濃度的增加，BC產(chǎn)量呈先增加后略微下降的趨勢(shì)，當(dāng)乳酸、乙酸和琥珀酸含量分別在0.6、2.0、1.5 g·L-1時(shí)，BC產(chǎn)量最高，且添加乳酸和乙酸條件下BC產(chǎn)量提高幅度高于添加琥珀酸。由此可以看出，乳酸和乙酸比琥珀酸更容易被木醋桿菌利用。Naritomi等[21]和Yang等[22]的研究均表明，乙酸和乳酸不是作為BC合成的底物，而是僅參與能量代謝，為BC合成和維持菌體代謝活性提供能量。琥珀酸作為T(mén)CA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，雖然也可被菌體利用，但其在胞內(nèi)的含量可能已經(jīng)能夠維持代謝平衡，因此，BC產(chǎn)量沒(méi)有隨著其添加量的增加而顯著增加。

圖3 浸米水培養(yǎng)基中添加不同濃度有機(jī)酸增效因子對(duì)BC產(chǎn)量的影響

在浸米水基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加醇類(lèi)增效因子(乙醇和甘油)條件下，BC的產(chǎn)量如圖4所示。乙醇和甘油均可以作為碳源被木醋桿菌利用，但乙醇可被直接作為底物利用，而甘油則需要通過(guò)復(fù)雜的糖異生途徑才能參與到BC合成途徑中[25]。因此，雖然甘油可以作為底物用于BC合成，但有蔗糖存在時(shí)并不會(huì)作為優(yōu)先碳源使用。此外，Yunoki等[17]的研究表明，乙醇不作為木醋桿菌合成BC的底物，其進(jìn)入胞內(nèi)后首先被氧化成乙酸、參與能量代謝，促進(jìn)葡萄糖的聚合，提高了葡萄糖合成BC的效率，進(jìn)而促進(jìn)BC合成。因此，添加乙醇條件下BC合成量顯著高于添加甘油條件下。

圖4 浸米水培養(yǎng)基中添加不同濃度醇類(lèi)增效因子對(duì)BC產(chǎn)量的影響

在浸米水基礎(chǔ)培養(yǎng)基中將乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油按其最適量添加后，BC最終產(chǎn)量為8.4 g·L-1，雖然低于以椰子水為原料生產(chǎn)BC的水平(11.2 g·L-1)(圖5)，但生產(chǎn)原料更經(jīng)濟(jì)，因此，仍具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。

圖5 浸米水培養(yǎng)基中添加混合增效因子對(duì)BC產(chǎn)量的影響

3 小結(jié)

本研究通過(guò)考察浸米水培養(yǎng)基中添加不同小分子有機(jī)酸和醇類(lèi)對(duì)BC產(chǎn)量的影響，明確了對(duì)以浸米水為原料發(fā)酵BC具有促進(jìn)作用的增效因子及其最適添加量，即乳酸0.6 g·L-1、乙酸2.0 g·L-1、乙醇20.0 g·L-1、琥珀酸 1.5 g·L-1和甘油2.0 g·L-1。將增效因子按其最適添加量混合加入浸米水培養(yǎng)基中，BC產(chǎn)量比對(duì)照提高3.59倍。浸米水是黃酒產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物之一，利用浸米水生產(chǎn)BC，可大幅降低黃酒廠超標(biāo)污水的排放量，且在不增加投入昂貴設(shè)備的前提下，實(shí)現(xiàn)浸米水提質(zhì)增效的目的。此外，BC生產(chǎn)原料范圍擴(kuò)大，可大幅提高BC產(chǎn)量以滿足其需求的上漲，促進(jìn)我國(guó)BC產(chǎn)業(yè)發(fā)展。