一、材料與方法

（一）試驗材料

1.藥品。40%辛硫磷乳油，江蘇寶靈化工股份有限公司生產(chǎn)。

2. 供試土壤。供試土壤采自景泰、隴西及蘭州市安寧區(qū)長期施用辛硫磷的蔬菜地。

3.儀器設(shè)備。恒溫振蕩搖床，超凈工作臺，高壓濕熱滅菌鍋，人工氣候箱，紫外可見分光光度計。

4.培養(yǎng)基。一是基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7 h2O 0.5 g；K2PHO4·3 h2O 1.31 g；FeSO4·7 h2O 0.018 g；NaNO33.0 g；KCl 0.5 g；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽滅菌30 min。二是以辛硫磷為唯一碳源的培養(yǎng)基：MgSO4·7 h2O 0.5 g；K2PHO4·3 h2O 1.31 g；FeSO4·7 h2O 0.018 g；NaNO33.0 g；KCl 0.5 g；辛硫磷100～600 mmol；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽滅菌30 min。三是LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g；酵母粉5.0 g；NaCl 10.0 g；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽滅菌30 min。

（二）試驗方法

1.土壤中降解菌的馴化。菌種的馴化方式采用逐漸加量的馴化方式。取土樣10 g，將土樣加入辛硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mmol/L的100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7 d，然后取10 mL培養(yǎng)液接入100 mL新鮮基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中辛硫磷濃度每一周期逐步提高，濃度依次為200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L），振蕩培養(yǎng)7 d，連續(xù)馴化富集4次。

2.菌種的分離和純化。每一馴化周期，均取培養(yǎng)液稀釋涂布于上述培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，待長出菌落后，挑取生長速度較快，菌落大而形態(tài)不一的菌落進(jìn)一步分離，挑選典型的單菌落，反復(fù)純化，直到菌落表面顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征完全一致，保存。

3.菌株生長曲線的測定。取適量的純化菌株S1分別接入50 mL LB培養(yǎng)基和辛硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mL（300 mmol/L）的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)到對數(shù)生長期（OD600達(dá)到0.6），將在LB中預(yù)培養(yǎng)的菌液按2%的接入量分別接入50 mL LB和辛硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mL（300 mmol/L）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將含辛硫磷（300 mmol/L）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)的菌液按2%的接入量接入辛硫磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mL（300 mmol/L）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，間隔8 h取樣，用紫外分光光度計測定菌體在波長600 nm處的吸光值，繪制生長曲線。

4.降解菌在不同初始農(nóng)藥濃度下的生長比較。選擇分離純化后生長良好的菌株S1接種于以辛硫磷為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，辛硫磷設(shè)置100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L 、500 mmol/L、600 mmol/L 6個不同濃度梯度，每處理3次重復(fù)。在28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)72 h后，使用紫外分光光度計測定菌體在波長600nm處的吸光值，然后進(jìn)行比較。取只加農(nóng)藥不接降解菌的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的吸光值校為零。

二、結(jié)果與分析

（一）降解菌的生長曲線測定結(jié)果

生長曲線測定結(jié)果如圖1所示，在LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)到對數(shù)生長期（OD600達(dá)到0.6）再以2%的接種量接種到50 mL LB培養(yǎng)基中的菌株，菌株生長遲緩期只有4 h，然后菌株迅速進(jìn)入對數(shù)生長期。培養(yǎng)20 h菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期，到24 h就達(dá)到最大生長量，菌株的濃度不再增加。

在辛硫磷培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)再以2%的接種量接種到辛硫磷培養(yǎng)基的菌株，菌株生長遲緩期有8 h，然后菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期持續(xù)時間達(dá)32 h，培養(yǎng)40 h進(jìn)入穩(wěn)定期，到48 h達(dá)最大生長量，菌株的濃度不再增加。

（二）降解菌在不同初始農(nóng)藥濃度下的生長比較

由圖2可知，菌株S1在辛硫磷濃度分別為100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的OD600nm吸光值值明顯小于辛硫磷濃度300 mmol/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的OD600nm吸光值。菌株S1降解辛硫磷的效率在辛硫磷濃度為300 mmol/L效率最高。低農(nóng)藥濃度下菌株S1生長較弱，由于碳源不足，抑制菌株生長，從而抑制了其對辛硫磷的降解。隨著初始農(nóng)藥濃度增加，菌體生長漸好，辛硫磷濃度為300 mmol/L時吸光值達(dá)到最大值，農(nóng)藥降解效果最好。辛硫磷濃度持續(xù)增加時，菌株S1生長放緩，農(nóng)藥濃度過高對菌株有毒害作用，抑制菌株生長，導(dǎo)致菌株對辛硫磷的降解降低。

（三）降解菌在不同溫度下的生長比較

由圖3可知，溫度對菌株S1的生長影響非常顯著，在25 ℃時，菌株OD600nm吸光值最大，菌株生長最好，隨著溫度的升高，其生長明顯受到抑制。由此可以推測，菌株S1的在中低溫時降解效果較好。甘肅省氣溫日差較大，年平均氣溫在0～14 ℃，而菌株S1在中低溫中生長較好，說明菌株S1能在該省大部分地區(qū)的土壤中生長。

三、結(jié)論

從試驗可以看出，溫度及初始農(nóng)藥濃度對菌株的生長都有一定影響。至于初始pH值、接種量等對菌株的生長影響尚需研究。菌株S1在辛硫磷初始濃度為300 mmol/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，28 ℃、120r/min搖床培養(yǎng)40 h，對辛硫磷的降解率初步測定達(dá)到56.45%，說明菌株S1能降解辛硫磷，菌株S1作為辛硫磷降解菌有進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)并應(yīng)用于治理河南省有機磷農(nóng)藥污染等方面的潛力。

圖1 菌株S1生長曲線圖

圖2 初始農(nóng)藥濃度對菌株S1的生長影響

圖3 溫度對苗株S1的生長影響