盛禮建 王巧剛 王巧燕

浙江省東陽市人民醫(yī)院 322100

在男性不育患者中，弱精子癥或精子無力癥約占19%，已成為男性不育的主要病因之一[1]。細胞中進行有氧氧化的主要細胞器是線粒體，其通過有氧氧化為細胞各項生命活動提供能量。在男性生殖中，線粒體通過氧化磷酸化為精子運動提供能量基礎(chǔ)。科學(xué)研究顯示，精子活力下降與線粒體基因的缺失和突變有一定的相關(guān)性[2]。本實驗旨在尋找精子運動情況與mtDNA 缺失的相關(guān)性，在分子水平上尋找男性不育的原因，為該病的診斷和治療提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)和研究方向。

1 資料與方法

1.1 樣本收集 選取2017年1—12月我院生殖中心因男性不育就診的患者，年齡25～38歲，平均年齡32歲，有3～5年不育病史，其配偶婦產(chǎn)科檢查正常，弱精子癥患者診斷參照WHO標(biāo)準(zhǔn)：a級<25%且a+b級精子<50%，共100例作為觀察組。同時，選取在東陽市人民醫(yī)院生殖中心因女性不孕就診的健康男性，年齡25～38歲，平均年齡31.5歲，精液常規(guī)檢查正常，精子活力正常，a級>25%且a+b級精子>50%樣本，共100例作為對照組。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。以上樣本均在禁欲3～5d后，用手淫法留取，37℃恒溫水浴箱內(nèi)30min內(nèi)液化后進行分析。

1.2 方法

1.2.1 精子DNA的制備：精子樣本用血細胞基因小量制備試劑盒提取精子總DNA，紫外分光光度計定量分析。

1.2.2 根據(jù)正式發(fā)表的mtDNA全序列，設(shè)計兩對PCR擴增引物，委托由上海生物工程公司合成?？俶tDNA(大小533bp)其擴增用的引物序列是：

上游引物F1 5’-AACATACCCATGGCCAACCT-3’；

下游引物R15’-GGCAGGAGTAATCACGGTCA-3’。

mtDNA 4 977bp缺失(大小524bp)其擴增用的引物序列是：

上游引物F2 5’-CCGGGGGTATAGACGGTCA-3’；

下游引物R2 5’-GCGGAAGCGAGGTTGACCTG-3’。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃退火50s，72℃延伸1min，32個循環(huán)，最后72℃延伸7min；PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理分析，計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總mtDNA以及4 977bp片段缺失的mtDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析 以提取的DNA為模板，通過上游引物F1 5’和下游引物R1 5’進行擴增獲得總mtDNA，凝膠電泳圖顯示擴增出大小為533bp的條帶，最終經(jīng)測序確認；以F2 5’為上游引物和R2 5’為下游引物對4 977bp片段缺失的mtDNA擴增，凝膠電泳圖顯示擴增出大小為524bp的條帶，最終經(jīng)測序確認，具體見圖1。證明精子DNA提取方法以及總mtDNA和4 977bp片段缺失的mtDNA和擴增引物設(shè)計合成可靠。

圖1 總mtDNA和4 977bp片段缺失的mtDNA凝膠電泳結(jié)果

注：1：4 977bp片段缺失的mtDNA，2：總mtDNA，3：DNA marker。

2.2 mtDNA4 977bp缺失結(jié)果統(tǒng)計分析 在100例弱精子癥患者(觀察組)中，擴增出mtDNA 4 977bp缺失擴增產(chǎn)物的有64例，缺失率高達64%；而在100例精子活力正常標(biāo)本(對照組)中，擴增出mtDNA 4 977bp缺失擴增產(chǎn)物的只有6例，缺失率僅為6%；兩組間比較，差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=73.934，P<0.01)。

3 討論

目前，隨著工業(yè)高速發(fā)展，人們生活節(jié)奏的加快，工作壓力的增加，不孕不育正逐漸成為全世界生殖健康一個共同的問題。流行病學(xué)研究表明，不發(fā)達國家育齡期夫婦不孕不育率在9%～30%之間，而在發(fā)達國家也有約15%[3]；導(dǎo)致不孕不育的病因中，由男性因素導(dǎo)致的不育為30%～50%[4]。導(dǎo)致男性不育的因素有很多，弱精子癥是導(dǎo)致男性不育的主要因素之一。導(dǎo)致弱精子癥的病因眾多，包括染色體異常、精索靜脈曲張、免疫、感染、內(nèi)分泌等多種因素，此外沒有明確病因的大約占到10%。通過弱精子癥的分子機制研究表明，精子活力低下，甚至是成年男性不育受到精子核基因組以及線粒體基因組突變的影響。Holyoake等[5]研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因位點9055和11719突變頻率與精子活力表現(xiàn)出一定的負相關(guān)性。通過對精子線粒體基因組以及精子線粒體的研究表明，通常在弱精子癥患者中，異常線粒體如線粒體粘連、缺損、小線粒體等具有較高的比例，而在精子活力正常者中異常線粒體比例較低。在mtDNA的突變率方面，弱精子癥患者也與正常人群間存在顯著性差異，其突變率明顯高于精子活力正常者。發(fā)生在mtDNA上的大片段缺失或點突變往往會影響線粒體蛋白質(zhì)的正常功能，導(dǎo)致氧化磷酸化功能障礙，ATP生成不足，最終導(dǎo)致男性精子活力不足。

研究發(fā)現(xiàn)在不育癥患者中，尤其是精子活力減低的患者中存在大量mtDNA缺失現(xiàn)象[6-11]。Kao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在活力低下精子中發(fā)生大片段缺失的概率顯著高于正常活力精子。Ieremiadou等研究表明，精子mtDNA 4 977bp缺失與精子活力及精子受精能力呈負相關(guān)，提示4 977bp缺失可能是弱精子癥的病因之一。mtDNA 4 977bp位點的缺失和其他類型突變將減少mtDNA 編碼的氧化磷酸化相關(guān)蛋白的合成，從而影響ATP的合成，導(dǎo)致精子活動能量供應(yīng)不足，繼而引起弱精子癥和不育癥。本文對100例弱精子癥不育患者的mtDNA 4 977bp缺失檢測發(fā)現(xiàn)，高達64例有mtDNA 4 977bp的缺失，而100例精子活力正常的對照樣本中，只有6例檢測出mtDNA 4 977bp缺失，兩組間顯示出明顯的差異性(P<0.01)，提示mtDNA 4 977bp缺失與弱精癥的發(fā)生有一定的負相關(guān)性。

綜上所述，mtDNA 缺失特別是mtDNA 4 977bp缺失與男性不育呈現(xiàn)出一定的負相關(guān)性，本研究為今后從分子水平研究弱精癥以及男性不育的發(fā)病機制提供了一定的科學(xué)依據(jù)，為男性生殖的研究指點了一定的方向。