李衛(wèi)峰， 蘇麗萍， 胡夏韻， 蒲紅偉,4

(1成都三六三醫(yī)院病理科， 成都 610000； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊 830054，3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室， 烏魯木齊 830011； 4河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室， 石家莊 050000)

海洛因海綿狀白質(zhì)腦病(HSLE)是由于長期吸食海洛因，致腦組織部分區(qū)域呈空泡狀變性，組織疏松呈海綿樣改變，海洛因選擇性地作用腦組織，產(chǎn)生損傷、中毒性改變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[1]。HSLE被認為是一種非特異性脫髓鞘病變，可導(dǎo)致細胞空泡樣變性和細胞壞死，是海洛因引起中毒性腦病最常見和最早的表現(xiàn)，可發(fā)生神經(jīng)細胞大量程序性死亡[2]。

細胞凋亡(apoptosis)是機體維持體內(nèi)平衡和生長發(fā)育的重要生理過程，細胞在基因的自我調(diào)節(jié)控制下，機體內(nèi)凋亡因子啟動并導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD)過程。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-ɑ)作為死亡受體途徑中的重要因子，能夠引起腫瘤細胞發(fā)生壞死，在自身免疫反應(yīng)和細胞凋亡中發(fā)揮主導(dǎo)調(diào)控作用。Rho蛋白廣泛分布于哺乳類動物的組織細胞中，1985年被確認是哺乳類動物Ras基因的同系物(ras homologue,Rho)，是Ras超家族的一個亞群，被稱為小G蛋白超家族，對細胞有絲分裂、粘附、細胞骨架調(diào)整、肌肉收縮、腫瘤細胞浸潤、細胞凋亡等一系列基本生命現(xiàn)象起著調(diào)控功能[3]。非受體酪氨酸激酶家族(cellular-abelson基因產(chǎn)物，C-Abl)廣泛存在哺乳動物中，其中C-AbI蛋白作為此家族主要成員，特別是在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，可調(diào)節(jié)細胞周期、DNA重組、修復(fù)和凋亡的發(fā)生發(fā)展，決定細胞的生存與凋亡[4]。然而，TNF-ɑ、Rho和C-AbI是否參與海洛因致神經(jīng)元病變的機制文獻少有報道。本課題研究海洛因成癮大鼠模型，通過海洛因?qū)Υ笫笠欢〞r間的作用條件下，對激活凋亡路徑的活化蛋白TNF-ɑ、Rho、C-AbI進行檢測，分析研究TNF-ɑ、Rho、C-AbI在此凋亡過程中具體作用和意義。

1 材料與方法

1.1材料鹽酸納洛酮(批號：H20055758) 購自北京四環(huán)制藥有限公司,甲醛、蘇木精、酒精、伊紅購自北京中衫金橋技術(shù)生物有限公司。Rho、TNF-ɑ、C-AbI均購自于Abcam公司,海洛因由新疆維吾爾族自治區(qū)公安廳禁毒總隊提供，呈米黃色粉末及顆粒狀(純度為90%以上)。

1.2實驗動物及分組SPF級健康雄性SD大鼠90只(3月齡)，體質(zhì)量(200±20) g，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究院動物飼養(yǎng)中心統(tǒng)一喂養(yǎng)(動物許可證號：IACUC-20131224002)。參照Zhou等[5]方法并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，將SD大鼠隨機分為對照組(10只)和模型組(80只)，采用劑量遞增方法，初次海洛因劑量為5 mg/kg，隨后逐日劑量遞增2.5 mg/kg，每日于北京時間10：00和19：00進行皮下注射，持續(xù)注射30 d，建立海洛因成癮模型組。通過腹腔注射鹽酸納洛酮(0.8 mg/kg)催癮，判斷每只大鼠戒斷癥狀，評判成癮模型是否建立。模型成功建立后，連續(xù)給與海洛因恒定劑量注射大鼠10 d、20 d、30 d、40 d，按同樣方式腹腔注射同等體積的生理鹽水建立對照組。

1.3蘇木精—伊紅(HE)染色腹腔注射水合氯醛麻醉，快速斷頸，取小腦，10%的中性福爾馬林溶液固定3 d，組織脫水，包埋、切片(3～5 μm厚度薄片)，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟20 min，梯度酒精脫水，復(fù)染，分化，溫?zé)崴邓{，伊紅染色2 min，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.4電鏡觀察取對照組、海洛因成癮組和海洛因成癮40 d組大鼠小腦組織，體積1 mm×1 mm×1 mm作為電鏡材料，沖洗，戊二醛固定1周，梯度丙酮脫水；100%丙酮20 min清洗3次，環(huán)氧丙烷：環(huán)氧樹脂(PO∶EPON=1∶3)浸透各2 h、過夜、包埋，60℃下聚合2 d以上，制成電鏡切片，染色，置于透射掃描電鏡下觀察。

1.5脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(TUNEL)檢測對照組、海洛因成癮10 d組、海洛因成癮20 d組、海洛因成癮30 d組及海洛因成癮40 d組，取小腦組織制成石蠟切片，多聚甲醛15 min，加入蛋白酶K，37℃溫箱孵育20 min。加入混合液50 μL末端脫氧核苷酸(TdT)+450 μL脫氧尿嘧啶核苷三磷酸( dUTP)，37℃溫箱內(nèi)孵育1 h。浸入過氧化氫(H2O2)10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入80 μL生物素(POD)30 min，顯色，自來水終止，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.6免疫組織化學(xué)方法將各組大鼠小腦組織制作成石蠟切片，進行前期脫蠟和脫水程序，加入3% H2O2浸泡10 min，PBS 清洗，加入檸檬酸鈉溶液高溫抗原修復(fù)8 min，冷卻，PBS清洗。滴加稀釋好濃度的一抗(TNF-ɑ 濃度1∶200，Rho濃度1∶150，C-AbI濃度1∶50)于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。次日早晨取出室溫放置30 min，PBS清洗，加二抗，37℃溫箱孵育40 min，清洗，顯色，終止。復(fù)染，分化，返藍，脫水，透明，封片，顯微鏡下隨機拍照，從每只大鼠的切片中隨機選擇1張，并選取4個視野拍照。采用ImageProPlus6.0(Media Cybernetics)軟件進行定量分析，計算各組陽性染色面積，用所計算出的陽性染色面積表示蛋白的表達水平，取平均值。

1.7免疫印跡(WesternBlot，WB)檢測將每組冷凍保存的小腦組織，稱取100 mg組織，提取細胞總蛋白，進行蛋白定量，上樣，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加一抗(TNF-α濃度1∶1 500、Rho濃度1∶200，C-AbI、β-tubulin濃度均按1∶1 000)，4℃孵育過夜，取出，洗膜3次，加入二抗，室溫1 h，洗膜3次，顯色，圖像處理儀分析相關(guān)蛋白表達情況。

2 結(jié)果

2.1海洛因?qū)π∧X神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)的影響對照組大鼠小腦顆粒細胞排列整齊均勻，染色均衡，細胞核形態(tài)清晰，間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰完整。海洛因成癮組大鼠小腦白質(zhì)神經(jīng)細胞數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)細胞內(nèi)出現(xiàn)小空泡(箭頭所指)，多個小空泡可以合并較大腔隙，周圍炎癥細胞浸潤不明顯(圖1)。

a: 對照組 b: 海洛因成癮組

2.2電鏡觀察對照組神經(jīng)元細胞形態(tài)完清晰，排列整齊，細胞突起成交叉網(wǎng)格狀，線粒體密集，結(jié)構(gòu)完整(圖2a、b)；海洛因成癮組神經(jīng)元細胞胞核固縮變小，核染色質(zhì)密集，細胞器密集，線粒體輕微度腫脹(圖2 c箭頭所指)，核膜皺縮，核密度降低，胞體腫脹(圖2d箭頭所指)；成癮40 d組，神經(jīng)元細胞軸突減少、胞體皺縮，胞漿破碎、線粒體大量腫脹或崩解，嵴排列紊亂或斷裂，部分空泡化(圖2e箭頭所指)，染色質(zhì)加深，髓鞘水腫(圖2f箭頭所指)。細胞突觸高度水腫，圍繞毛細血管或分布于神經(jīng)氈內(nèi)與周圍水腫的突觸使神經(jīng)氈呈疏松的網(wǎng)孔狀、海綿狀外觀，細胞核固縮，染色質(zhì)加深(圖2 e、f)。

2.3細胞凋亡與正常細胞不同，凋亡細胞主要是在細胞核呈黃褐色。海洛因成癮10 d組神經(jīng)元細胞胞核開始出現(xiàn)少量黃褐色(圖3b)，與對照組比較細胞凋亡數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；海洛因成癮各組的細胞凋亡率顯著高于對照組(圖3b～e)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著海洛因給藥天數(shù)的增加，細胞核出現(xiàn)黃褐色數(shù)量逐漸增多，經(jīng)統(tǒng)計顯示在海洛因成癮10 d組、20 d組30 d組和40 d組細胞凋亡率分別為(13.44±4.67)%，(26.4±3.01)%，(38.80±3.96)%，(46.4±8.05)%，對照組為(3.4±1.14)%(圖3f)，在給藥時間和劑量延長情況下，細胞凋亡數(shù)量增加，這表明長期使用海洛因可致大鼠小腦神經(jīng)元細胞產(chǎn)生凋亡。

2.4免疫組化檢測結(jié)果在海洛因成癮10、20、30 d和40 d組TNF-α蛋白明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[其中30 d和40 d組TNF-α蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)]，TNF-α蛋白表達在胞漿和胞膜上,見圖4、表1。Rho蛋白在海洛因成癮各組中表達明顯升高且高于對照組，差異統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Rho蛋白表達在胞質(zhì)上見圖4、表1；而各組中的C-AbI蛋白的表達無明顯變化，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4、表1；隨著海洛因給藥時間的延長，TNF-ɑ和Rho神經(jīng)元凋亡變化趨勢相同，這提示其與神經(jīng)元凋亡相關(guān)，而C-AbI對成癮大鼠動物模型神經(jīng)元凋亡無明顯相關(guān)性。

a、b： 對照組大鼠小腦組織(8、12 kv)； c、d： 海洛因成癮組大鼠小腦組織(8、12 kv)； e、f： 海洛因成癮40 d組大鼠組織(8、12 kv)

a: 對照組 b: 海洛因成癮10 d組 c: 海洛因成癮20 d組

d: 海洛因30 d組 e: 海洛因成癮40 d組 f: 各組細胞凋亡數(shù)量柱狀圖

TNF-α

C-AbI

表1 TNF-α,Rho 和C-AbI 蛋白在海洛因成癮大鼠小腦組織表達

注： 與對照組比較,*P<0.05。

2.5Westernblot法檢測TNF-ɑ、Rho和C-AbI蛋白的結(jié)果TNF-α蛋白在海洛因成癮各組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，海洛因成癮10 d組和20 d組蛋白表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在海洛因成癮(30 d組和40 d組)蛋白表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在海洛因成癮20 d，30 d和40 d組Rho蛋白明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在10 d組蛋白表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而C-AbI蛋白在各組表達無明顯變化，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著海洛因給藥時間的延長，TNF-ɑ和Rho對成癮大鼠腦組織細胞凋亡存在影響，而C-AbI對成癮大鼠腦組織細胞凋亡無明顯相關(guān)性(圖 5a、b)。

3 討論

海洛因(化學(xué)名稱：二乙酰嗎啡)是阿片受體結(jié)合物,長期吸食海洛因可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生嚴重的器質(zhì)性疾病，其典型病變?yōu)楹＞d狀白質(zhì)腦病(SLE)[6]。1982年Wolters等[2]首次報道了海洛因海綿狀白質(zhì)腦(HSLE)的病理特征和臨床癥狀，其主要作用小腦白質(zhì)、腦干胼胝體、內(nèi)囊、腦干等損傷，組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)海綿狀和空泡樣改變。海洛因具有特異性神經(jīng)毒素，可破壞額葉灰質(zhì)、扣帶和枕葉皮質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞凋亡，線粒體功能障礙，突觸缺陷，細胞內(nèi)鈣超載，線粒體膜電位(MMP)升高和ATP水平降低等[7-9]。在長期濫用海洛因情況下，機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)會持續(xù)受損，特別是神經(jīng)細胞可發(fā)生廣泛的病理改變，其中小腦顆粒神經(jīng)元凋亡是其典型的病變特征，這是中毒性腦病的基本病理變化，亦屬于特殊類型的中毒性腦病，對其發(fā)生原因機制目前尚不清楚。

a: 對照組； b： 海洛因成癮10 d組； c： 海洛因成癮20 d組； d： 海洛因成癮30 d組； e： 海洛因成癮40 d組

本課題建立大鼠海洛因成癮模型，在海洛因作用下大鼠小腦神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯減少，神經(jīng)細胞內(nèi)出現(xiàn)多個小空泡，多個小空泡可以合并較大腔隙，周圍炎癥細胞浸潤不明顯，這種改變與神經(jīng)細胞凋亡結(jié)構(gòu)相似。在海洛因成癮組中神經(jīng)元細胞核染色質(zhì)和胞內(nèi)細胞器密集，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有輕度腫脹。在延長海洛因給藥時間(海洛因成癮40 d組)時，小腦組織結(jié)構(gòu)松散，神經(jīng)細胞突起減少、胞體皺縮，神經(jīng)元胞漿破碎、線粒體腫脹或崩解，嵴排列紊亂或斷裂，有部分出現(xiàn)空泡化，核固縮，染色質(zhì)顏色加深。該細胞突起呈高度水腫，圍繞毛細血管的突觸出現(xiàn)疏松狀的網(wǎng)眼狀和海綿狀外觀，這與Kriegstein等[10]和Yin等[11]研究的海洛因可致神經(jīng)細胞變性壞死結(jié)果較為相似。隨著海洛因給藥時間的延長，小腦神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量逐漸增多，這進一步證實了海洛因海綿狀白質(zhì)腦病(HSLE)的存在。因此，本研究認為海洛因成癮的大鼠主要以SLE為主要病變，病理表現(xiàn)主要是神經(jīng)元細胞變性并伴有細胞凋亡形式。

細胞凋亡程序的激活受多種因素影響, 但凋亡信號通路卻比較保守和單一，主要兩種途徑調(diào)控：內(nèi)在線粒體途徑和外在死亡受體途徑。死亡受體Fas的配體是Fas配體(FasL)，腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)的配體為TNF-α，它是研究較為明確的死亡受體和配體[12]，TNF-α是腫瘤壞死因子，在調(diào)控機體免疫和細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，還可誘導(dǎo)機體對腫瘤組織發(fā)揮作用而導(dǎo)致細胞壞死。有研究報道，過量表達的TNF-α可導(dǎo)致帕金森病(PD)、中風(fēng)及阿爾茨海默氏病(AD)等病理性改變，這主要是細胞凋亡過程發(fā)生紊亂[13]。TNF在與受體進行結(jié)合后，不但可活化FADD-Caspase-8 通路，還可以激活NF-κB 通路和C-jun/JNK信號通路,主要是與TRAIL結(jié)合發(fā)揮細胞凋亡過程。TNF-α蛋白的表達可受到相關(guān)因子調(diào)控和阻礙，抑制TNF-α蛋白的產(chǎn)生可以相應(yīng)減少細胞凋亡的發(fā)生，海洛因作用大鼠腦組織細胞是否會干預(yù)TNF-α表達，是否會導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡,有待證實。Rho是小G 蛋白超家族的一員,可調(diào)控生物體一系列生命現(xiàn)象，比如有絲分裂、肌肉收縮強度、腫瘤細胞浸潤和增殖以及細胞凋亡等，并在機體組織中廣泛存在，其過表達可導(dǎo)致生長錐塌陷和突起回縮，抑制則可促使細胞突起生長[14]。Rho因子是C-jun/JNK信號傳導(dǎo)途徑的上游信號，可與p21激活的絲/蘇氨酸激酶(p21-activatingkinase，PAK) 結(jié)合，磷酸化而激活c-jun/JNK凋亡信號路徑。有研究者在Ras/Raf誘導(dǎo)的果蠅腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)異常增殖，主要是Rho激酶對JNK與Raf起協(xié)同作用，同時，可特異性減輕腦血管痙攣[15]、改善腦血流代謝、縮小梗死體積[16]和改善神經(jīng)功能缺損[17]，但其是否調(diào)控海洛因作用神經(jīng)系統(tǒng)的過程尚未完全闡明。非受體酪氨酸激酶Abl家族的重要成員C-AbI蛋白廣泛存在哺乳動物細胞中，可調(diào)節(jié)細胞周期、DNA重組修復(fù)和細胞凋亡，從而決定細胞在此氧化應(yīng)激反應(yīng)中的生存與凋亡。在細胞外刺激因子(如紫外線和TNF-α應(yīng)激損傷)的作用下，C-AbI與轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的抑制因子IkBa相互作用并增強IkBa的穩(wěn)定性，并促進其進入細胞核與NF-KB結(jié)合抑制后者的轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[18-19]。因此，Rac途徑中的Rho蛋白和旁路途徑中的C-AbI是否參與海洛因作用大鼠腦組織細胞損傷的過程,是否誘導(dǎo)了神經(jīng)元凋亡,基于以上問題，本課題組研究結(jié)果：在海洛因成癮組中TNF-α蛋白在胞質(zhì)以及胞膜上呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且隨著注射海洛因時間的延長而明顯增多，與海洛因的給藥時間和劑量呈依賴關(guān)系，這種依賴關(guān)系也使神經(jīng)元細胞的凋亡數(shù)量隨海洛因藥物的增加而增多，因此說明TNF-α參與了海洛因致神經(jīng)元凋亡的過程，在一定程度發(fā)揮了死亡受體調(diào)控凋亡的相關(guān)作用。在海洛因成癮組Rho 蛋白亦顯著上調(diào)，并隨著給藥時間的延長，Rho 蛋白表達量呈現(xiàn)上升趨勢，具有明顯的時間依賴關(guān)系，這進一步也表明Rho蛋白也參與了海洛因致神經(jīng)元凋亡過程。有研究表明C-AbI激活后，能夠?qū)毎Ｉ砘顒赢a(chǎn)生影響，可引發(fā)細胞周期阻滯，嚴重時可誘發(fā)細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象 。但是，課題組在研究C-AbI蛋白時發(fā)現(xiàn)，在長時間海洛因作用大鼠過程中，小腦組織中基本無表達，高濃度海洛因作用大鼠時，C-AbI蛋白亦無表達，與對照組沒有顯著差異，這表明C-AbI在海洛因致神經(jīng)元損傷過程中可能沒有發(fā)揮調(diào)控作用，這結(jié)果與Avram等[22]研究認為C-AbI具有抗凋亡的作用不一致。那么C-AbI在海洛因致神經(jīng)元凋亡過程究竟發(fā)揮怎樣的作用還需本課題組進一步深入研究證實。

本課題組在前期研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，凋亡過程中相關(guān)因子P-C-Jun、cytc、Caspase-8等蛋白與TNF-ɑ、Rho蛋白在海洛因作用大鼠時間和濃度變化趨勢基本相似，由此我們認為JNK/C-Jun 與TNF-α、Rho是相互作用的結(jié)果，這與Yarza等[20]觀點相一致。在海洛因作用下，激活JNK激酶可上調(diào)TNF-α因子的合成，而TNF-α因子與JNK可以起到雙向調(diào)節(jié)作用，因此反過來它又可以促進JNK 的進一步活化，從而形成雙向循環(huán)使其效應(yīng)進一步放大。Rho 蛋白亦可能是與PAK相結(jié)合，使其磷酸化而被激活，從而進一步使C-jun/JNK凋亡信號通路激活而發(fā)揮凋亡作用。本課題在體外培養(yǎng)神經(jīng)元細胞，海洛因長期作用后而導(dǎo)致TNF-α升高的結(jié)果與動物實驗長期吸食阿片類物質(zhì)(海洛因)導(dǎo)致TNF-α蛋白升高相一致，進一步明確了阿片類物質(zhì)可直接影響TNF-α表達。這一定程度說明了死亡受體途徑和神經(jīng)酰胺途徑對激活JNK信號通路在海洛因致神經(jīng)元細胞凋亡過程中起促凋亡作用。TNF-α和Rho因子可作為治療靶向因子，為臨床上預(yù)防海洛因吸食者發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)及因濫用而發(fā)生猝死提供臨床診療依據(jù)，也為法醫(yī)學(xué)上因為海洛因濫用發(fā)生腦卒中提供理論依據(jù)。而C-AbI因子在此過程中變化不明顯，提示旁路激活途徑在海洛因致神經(jīng)元細胞凋亡過程中可能未發(fā)揮作用，這還需課題組深入研究和進一步探索。