，，

浙江麗水市婦幼保健院婦產(chǎn)科浙江麗水

出生缺陷是指由于遺傳、環(huán)境、染色體或基因異常等因素造成胎兒或胚胎在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)一系列諸如先天性心臟病、唇腭裂、無(wú)腦兒或者脊柱裂等結(jié)構(gòu)和功能異常的疾病，其在我國(guó)的發(fā)生率高達(dá)5.6%[1-2]。由于出生缺陷的具體發(fā)病機(jī)制尚未得到明確，近年來(lái)越來(lái)越來(lái)資料顯示出生缺陷與基因多態(tài)性關(guān)系密切，葉酸代謝相關(guān)基因和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)則最為常見。由于甲硫氨酸合成還原酶(methionine synthase reductase，MTRR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)為葉酸代謝相關(guān)基因的關(guān)鍵酶，當(dāng)MTRR及MTHFR的基因位點(diǎn)多態(tài)性改變時(shí)可顯著增加血清中Hcy的表達(dá)水平，目前臨床上普遍認(rèn)為適當(dāng)補(bǔ)充葉酸水平可顯著減少Hcy表達(dá)水平，在妊娠期婦女孕前及孕后3個(gè)月內(nèi)則為最佳時(shí)機(jī)，可顯著減少出生缺陷的發(fā)生率[3-4]。然而關(guān)于葉酸的最佳補(bǔ)充劑量、作用機(jī)制尚未得到明確，因此本研究通過(guò)麗水市婦幼保健院婦產(chǎn)科2017年11月至2018年5月657例進(jìn)行孕檢的孕婦作為研究對(duì)象分析不同葉酸代謝關(guān)鍵酶基因型及個(gè)體化補(bǔ)充葉酸對(duì)孕婦血清Hcy水平和出生缺陷發(fā)生的影響。

1研究對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

將浙江麗水市婦幼保健院婦產(chǎn)科2017年11月至2018年5月657例進(jìn)行孕檢的孕婦作為研究對(duì)象；年齡為20～35歲，平均為(26.79±3.45)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①夫婦雙方均無(wú)家族遺傳性疾病；②夫婦雙方均無(wú)明顯解剖學(xué)異常；③夫婦雙方心肝腎功能均正常。

1.2方法

1.2.1分組情況

在首次孕檢時(shí)，對(duì)研究對(duì)象血清Hcy含量與MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T位點(diǎn)情況進(jìn)行測(cè)定。按照基因檢測(cè)結(jié)果，可將個(gè)體對(duì)葉酸利用能力風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行劃分，分成高度風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)、低度風(fēng)險(xiǎn)及未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)共四等級(jí)[5]，見表1。其中，中高度風(fēng)險(xiǎn)共301例(A組)與低度風(fēng)險(xiǎn)+未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)共356例(B組)，評(píng)估未給予兩組孕婦葉酸處理時(shí)血清中Hcy的表達(dá)水平。其中，A組給予葉酸800μg/d，B組給予葉酸400μg/d，均至孕3個(gè)月。記錄兩組Hcy水平和新生兒出生缺陷情況。

表1葉酸利用能力基因檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的劃分

Table 1 Division of risk level for gene detection of folic acid utilization

1.2.2標(biāo)本采集及檢測(cè)

首次孕檢時(shí)均通過(guò)收集兩組孕婦的口腔粘膜上皮細(xì)胞并通過(guò)Taqman-MGB技術(shù)行基因檢測(cè)(MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T多態(tài)性)，其中基因檢測(cè)探針及試劑均由蘇州泰通基因檢測(cè)器械有限公司提供，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T位點(diǎn)行熒光定量測(cè)定，其中每個(gè)反應(yīng)體系總體積為10L，于95℃恒溫箱反應(yīng)10min后采用PCR擴(kuò)增儀于92℃恒溫箱反應(yīng)15s及60℃恒溫箱反應(yīng)60s行20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，后于89℃恒溫箱反應(yīng)15s及60℃恒溫箱反應(yīng)90s行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)PCR擴(kuò)增儀行熒光定量檢測(cè)讀取出終點(diǎn)熒光并通過(guò)相應(yīng)的分析軟件明確各種樣本的基因分型。抽出兩組孕婦清晨空腹外周靜脈血5mL行Hcy表達(dá)水平檢測(cè)。于兩組孕婦處于12～13孕周時(shí)，再次抽取空腹外周靜脈血5mL行Hcy表達(dá)水平檢測(cè)，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀并采用酶循環(huán)法檢測(cè)兩組孕婦血清中的Hcy的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1孕婦MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T基因分型結(jié)果

本研究納入的657例進(jìn)行孕檢的孕婦的三種基因分型均行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，結(jié)果均提示P>0.05，由此可大致將本樣本以代表本地區(qū)全部孕婦。657例進(jìn)行孕檢的孕婦MTRR A66G基因型GG、MTHFR A1298C基因型CC、C677T基因型TT三種純合突變頻率分別為6.39%(42/657)、5.78%(38/657)、26.94%(177/657),見表2。

表2孕婦MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T基因分型結(jié)果[n(%)]

Table 2 Genotyping results of MTRR A66G and MTHFR A1298C and C677T in pregnant women[n(%)]

基因基因型結(jié)果MTRR A66GAA385(58.60)AG230(35.01)GG42(6.39)MTHFR A1298CAA421(64.08)AC198(30.14)CC38(5.78)MTHFR C677TCC361(54.95)CT119(18.11)TT177(26.94)

2.2兩組孕婦補(bǔ)充葉酸前后Hcy表達(dá)水平的比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，個(gè)體化補(bǔ)充葉酸前，A組孕婦血清中Hcy的表達(dá)水平顯著高于B組(P<0.05)；個(gè)體化補(bǔ)充葉酸后，兩組孕婦血清中Hcy的表達(dá)水平提示無(wú)顯著差異(P>0.05)，見表3。

組別例數(shù)(n)補(bǔ)充前(μmol/L)補(bǔ)充后(μmol/L)A組30110.98±2.156.39±1.42B組3568.01±2.056.28±1.43t18.090.99P<0.010.33

2.3補(bǔ)充葉酸前所有孕婦Hcy對(duì)葉酸的利用能力ROC曲線分析

以中高度風(fēng)險(xiǎn)表示陽(yáng)性，以低風(fēng)險(xiǎn)及未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)為陰性，繪制個(gè)體化補(bǔ)充葉酸前所有孕婦Hcy對(duì)葉酸利用能力的ROC曲線，結(jié)果顯示當(dāng)血清中Hcy的表達(dá)水平超過(guò)8.55mol/L時(shí)，ROC曲線下面積為0.79，葉酸利用能力中重度風(fēng)險(xiǎn)的特異性及敏感度分別為78.09%、81.06%,見圖1。

圖1補(bǔ)充葉酸前所有孕婦Hcy對(duì)葉酸利用能力的ROC曲線

Fig.1 ROC curve of folic acid utilization of Hcy in pregnant women before folic acid supplementation

2.4兩組孕婦出生缺陷情況比較

兩組新生兒總出生缺陷率比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見表4。

表4 兩組孕婦出生缺陷情況比較[n(%)]

3討論

3.1造成高Hcy血癥的可能原因

已有文獻(xiàn)報(bào)道，高Hcy血癥是引發(fā)新生兒出生缺陷的獨(dú)立高危因素之一，這是由于Hcy具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性可直接影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，造成胎兒畸形、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢甚至是胎死宮中等嚴(yán)重后果[6-7]。造成這樣的原因可能是：①血清中Hcy濃度增加使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，同時(shí)刺激血小板的增殖，誘導(dǎo)血栓的形成，出現(xiàn)胎盤血管栓塞，從而阻斷胎盤幫助胎兒排出代謝產(chǎn)物或給予營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；②血清中Hcy濃度增加使機(jī)體內(nèi)的氧自由基及過(guò)氧化物分泌升高，導(dǎo)致DNA受損及細(xì)胞凋亡；③血清中Hcy濃度增加降低S-腺苷蛋氨酸的分泌，引起DNA低甲基化，導(dǎo)致染色體出現(xiàn)減數(shù)不分離現(xiàn)象；④血清中Hcy濃度增加可間接引發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，引起胎兒神經(jīng)管閉合不全，出現(xiàn)先天性心臟病及神經(jīng)管畸形的問題[8-9]。

3.2造成高Hcy血癥的直接原因

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，孕婦血清中的葉酸不足或相對(duì)不足是導(dǎo)致高Hcy血癥的一個(gè)直接原因[10]。其中，MTRR、MTHFR為葉酸代謝相關(guān)基因的關(guān)鍵酶，當(dāng)這二者出現(xiàn)基因多態(tài)性是可顯著減少機(jī)體內(nèi)的酶活性，引起血清中的Hcy無(wú)法向蛋氨酸內(nèi)轉(zhuǎn)化出現(xiàn)DNA低甲基化，同時(shí)大量的Hcy積聚于血清中，從而出現(xiàn)高Hcy血癥。目前臨床上主要采用補(bǔ)充葉酸以控制高Hcy血癥，其中圍孕期(妊娠期婦女孕前及孕后3個(gè)月)適量補(bǔ)充葉酸能有效防治出生缺陷已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可。然而，有文獻(xiàn)指出，在不同人群或者不同地區(qū)使用補(bǔ)充葉酸以降低高Hcy血癥的臨床療效相差較遠(yuǎn)[11]。據(jù)相關(guān)研究顯示，C677基因中的TT純合型突變可顯著降低酶的活性，可降低至30%，而CT雜合型突變則可使酶的活性減少35%[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，657例進(jìn)行孕檢的孕婦MTRR A66G基因型GG、MTHFR A1298C基因型CC、C677T基因型TT三種純合突變頻率分別為6.39%(42/657)、5.78%(38/657)、26.94%(177/657)，且具有明顯的地域差異，其中我國(guó)北方地區(qū)TT突變基因顯著高于南方地區(qū)，與相關(guān)參考文獻(xiàn)相一致[13]。由此可推測(cè)，MTHFR造成的區(qū)域分布差異與補(bǔ)充葉酸后預(yù)防出生缺陷的效果不一致相關(guān)。此結(jié)果也很好解釋神經(jīng)管畸形好發(fā)于我國(guó)北方地區(qū)的一定原因。

3.3個(gè)性化葉酸治療高Hcy血癥的意義

本研究按照基因測(cè)定結(jié)果，分為A組(301例)與B組(356例)。其中，A組給予葉酸400g/d，B組給予葉酸800g/d，均至孕3個(gè)月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)個(gè)體化補(bǔ)充葉酸前，A組孕婦血清中Hcy的表達(dá)水平顯著高于B組；個(gè)體化補(bǔ)充葉酸后，兩組孕婦血清中Hcy的表達(dá)水平提示無(wú)顯著差異；兩組新生兒出生缺陷提示無(wú)顯著差異。有文獻(xiàn)認(rèn)為，給予高Hcy血癥婦女大劑量的葉酸治療雖可以控制高Hcy血癥，但大劑量的葉酸也會(huì)提高婦女排卵的次數(shù)，出現(xiàn)多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，而且大劑量的葉酸會(huì)造成脂類代謝紊亂，導(dǎo)致血糖濃度劇增，提高血脈粥樣硬化的發(fā)生率[14]。因而本研究認(rèn)為臨床上應(yīng)該根據(jù)患者具體的葉酸利用能力制定個(gè)性化的給藥方法，降低大劑量葉酸服用帶來(lái)的毒副作用，提高臨床療效。同時(shí)本研究以中高度風(fēng)險(xiǎn)表示陽(yáng)性，以低風(fēng)險(xiǎn)及未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)為陰性作出補(bǔ)充葉酸前個(gè)體化補(bǔ)充葉酸前所有孕婦Hcy對(duì)葉酸的利用能力ROC曲線，結(jié)果顯示當(dāng)血清中Hcy的表達(dá)水平超過(guò)8.55mol/L時(shí)，提示葉酸利用能力中重度風(fēng)險(xiǎn)的特異性及敏感度分別為78.09%、81.06%?？梢妼?duì)于基層醫(yī)院采用Hcy以評(píng)估葉酸的利用能力并指導(dǎo)治療具有深刻的意義。

綜上所述，不同葉酸代謝關(guān)鍵酶基因型及孕婦血清Hcy檢測(cè)有利于為不同孕婦提供個(gè)體化補(bǔ)充葉酸治療，減少出生缺陷的發(fā)生率。但本研究尚存在一定不足，如未能檢測(cè)葉酸水平變化及膳食調(diào)查，文中僅采用Hcy作為單一評(píng)估指標(biāo)，而對(duì)反映葉酸代謝及正常值水平的多項(xiàng)指標(biāo)仍需今后進(jìn)一步拓展。