劉正奎，吳 瑗，陳 琳，王 磊，牟泓燁，祝徐航，王曉杜，*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物工程學(xué)院，浙江 金華321007)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)常感染3～10日齡仔豬，可引起該豬群發(fā)生豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)，臨床癥狀以急性腸炎和脫水致死為特征的高度傳染性疾病。PEDV感染豬群，仔豬發(fā)病率和死亡率都很高，一年四季均可發(fā)病，自2011年以來，新的變異毒株開始在各地紛紛流行[1-3]，現(xiàn)已出現(xiàn)在世界各個國家和地區(qū)[4-6]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[7-8]。

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬α型冠狀病毒，其復(fù)制酶蛋白是由ORF1a和ORF1b基因編碼的PP1a和PP1ab前體蛋白，經(jīng)病毒編碼蛋白酶加工而成，形成至少16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural proteins，NSPs)，從PP1a或PP1ab的氨基端起依次為Nsp1-16，這些蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、抗宿主細(xì)胞防御機制過程中發(fā)揮重要功能[9-10]。其中Nsp5被稱為3C樣蛋白酶[11]，是一種富含組氨酸和半胱氨酸的蛋白酶[12]，該蛋白酶具有切割活性，可以將多聚前體蛋白PP1ab切割為成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4-16[11]。除了具有切割活性外，還發(fā)現(xiàn)Nsp5是一種干擾素的拮抗分子[13]，同時在病毒復(fù)制過程中，對N蛋白進行加工修飾，調(diào)節(jié)PEDV對宿主細(xì)胞的適應(yīng)性[14]。因此，研究PEDV的Nsp5蛋白結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能對了解該病毒的致病機理，開發(fā)新型抗病毒藥物具有重要意義。本研究通過克隆Nsp5基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌進行表達(dá)，同時利用生物信息學(xué)軟件進行結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，為解析Nsp5的功能提供生物材料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PEDV/LY/2014/04分離株來自臨床腹瀉樣本，由本實驗室分離得到，保存于浙江農(nóng)林大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生實驗室；pET-28a(+)載體由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRⅠ購自NEB公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；KOD plus Neo購自TOYOBO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成

依據(jù)豬流行性腹瀉病毒CV777疫苗株全基因組序列(GenBank:KT323979)，利用序列比對方法，找到編碼Nsp5的基因，使用DNAStar中的Primer Select軟件進行Nsp5基因片段的引物設(shè)計。設(shè)計一對擴增Nsp5基因的特異性引物，上下游引物兩端添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點，擴增片段大小為616 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成，如表1。

1.3.2Nsp5基因擴增

采用TRIZOL法提取PEDV/LY/2014/04分離株的RNA，隨機引物反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，以此cDNA為模板進行目的片段Nsp5的PCR擴增。PCR擴增體系：rTaqMix 10 μL，dd H2O 6 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，共20μL。PCR擴增條件：預(yù)變性94 ℃ 3 min；94 ℃變性45 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表1Nsp5基因擴增引物及鑒定引物

Table1Nsp5 gene amplification primers and identification primers

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence(5’-3’)目的片段大小Product size/bpNsp5-FwdCCGGAATTCATGTTGCAGAGTGTTGCATCTACTTATGTAG616Nsp5-RevGACGTCGACTCACTGGAGCTTAACAATACGCTCACNsp5-FwdCCGGAATTCATGTTGCAGAGTGTTGCATCTACTTATGTAG705T7-TerminalGCTAGTTATTGCTCAGCGG

1.3.3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nsp5構(gòu)建

利用膠回收試劑盒將Nsp5擴增片段純化回收，利用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切，同時用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pET-28a(+)載體，酶切結(jié)束電泳后切膠回收，兩種酶切產(chǎn)物按照適宜比例，利用T4連接酶在16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素的平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定呈陽性的菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后，質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，再進行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送交上海生工生物有限公司進行測定驗證。測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名pET-28a(+)-Nsp5。

1.3.4 His-Nsp5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將1.3.3節(jié)構(gòu)建正確的pET-28a(+)-Nsp5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，分別挑選3～5個單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12～16 h，以此為種子液。種子液按照體積比1∶100轉(zhuǎn)接液體LB培養(yǎng)基里，當(dāng)菌液的D600值在0.5～0.6時，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前樣品，加入終濃度為1 mmoL·L-1的IPTG，在37 ℃、200 r·min-1進行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6 h后取1 mL菌液作為誘導(dǎo)后樣品，所取樣品處理后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后分析重組Nsp5蛋白表達(dá)情況。

1.3.5 His-Nsp5重組蛋白的純化

小量表達(dá)驗證成功的克隆，擴大培養(yǎng)后進行大量誘導(dǎo)，收集大量誘導(dǎo)表達(dá)菌體后，用PBS緩沖液重懸，冰浴超聲破碎30 min，離心收集包涵體沉淀。包涵體沉淀經(jīng)尿素溶解后，在4 ℃、12 000 r·min-1離心25 min，上清移至新的離心管；將上清與平衡過的鎳柱在4 ℃結(jié)合3～4 h，待結(jié)合液流出，加入30 mL 50 mmoL·L-1咪唑洗除雜蛋白，然后緩慢持續(xù)地加入5 mL 400 mmoL·L-1咪唑洗脫目的蛋白，收集洗脫下來的目的蛋白，酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，純化得到的蛋白加入等體積100%甘油，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。純化后目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，分析His band Ni+純化后重組蛋白的純度和表達(dá)量。

1.3.6 Nsp5蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

Vector NTI Advance 軟件對Nsp5蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)進行理論分析(包括分子質(zhì)量、等電點以及氨基酸組成等)，ProtScale(http://web.Expasy.org/protscale/)分析Nsp5蛋白質(zhì)的親水性與疏水性，ABCpred服務(wù)器在線分析了Nsp5蛋白的B細(xì)胞潛在抗原表位，SOPMA服務(wù)器在線分析了Nsp5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，Phyre2.0(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi？id=index)預(yù)測分析Nsp5蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)，Raswin軟件初步預(yù)測了Nsp5蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nsp5基因的PCR擴增及重組表達(dá)載體的PCR鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，大小約616 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)。將Nsp5的PCR產(chǎn)物和載體pET-28a(+)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切之后，經(jīng)T4連接酶連接，熱擊轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組載體pET-28a(+)-Nsp5。通過PCR的方法，鑒定引物為目的基因的上游引物Nsp5-Fwd和載體pET-28a(+)的T7-Terminal引物(表1)，同時通過雙酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)鑒定的方法，篩選并驗證得到陽性克隆(圖2)。陽性克隆送生物公司測序，序列比對結(jié)果表明，該序列與GenBank的PEDV毒株(KM213245)同源性高達(dá)99%，且編碼框插入正確。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nsp5轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)后樣品泳道出現(xiàn)了特異性蛋白表達(dá)，其分子質(zhì)量約為22 ku，與預(yù)期大小相符(圖3)。針對誘導(dǎo)后的包涵體沉淀，采用His band Ni+柱進行純化，所得樣品進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果獲得純度達(dá)到70%以上的重組蛋白(His-Nsp5)。

M，DL 2000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，陰性對照；2，Nsp5基因PCR擴增產(chǎn)物。M， DL 2000 bp DNA marker; Lane 1， Negative control; Lane 2， Nsp5 gene PCR products.圖1 Nsp5基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Nsp5 PCR products

M，DL 2000 bp DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，pET-28a(+)-Nsp5經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物。M， DL 2000 bp DNA marker; Lane 1， pET-28a(+)-Nsp5 digested by EcoRⅠ and SalⅠ.圖2 pET-28a(+)-Nsp5雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant pET-28a(+)-Nsp5 plasmid by double enzyme digestion

M，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker；1，pET-28a(+)-Nsp5未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)全菌樣品；2，pET-28a(+)-Nsp5經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后全菌樣品；3-5，pET-28a(+)-Nsp5包涵體純化后蛋白濃度由低到高的樣品。M， Low molecular weight standard protein marker; Lane 1， Non-induced pET-28a(+)-Nsp5; Lane 2: IPTG induced pET-28a(+)-Nsp5; Lane 3-5， Different concentrations of purified protein.圖3 Nsp5蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of Nsp5 protein expression

2.3 豬流行性腹瀉病毒Nsp5蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)

豬流行性腹瀉病毒的Nsp5的基因含有1個由591 bp組成的開放閱讀框，編碼196個氨基酸殘基組成的多肽，其中A+T=55.50%、C+G=44.50%，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的理論值為21 820.07 u，理論等電點(pI)為8.734，在正常生理狀態(tài)下，該蛋白帶正電荷；原子組成是C954H1553N275O291S9；正電荷殘基共有(Lys+Arg)24個，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)21個。該蛋白質(zhì)由16種氨基酸組成，其中Val、Ala、Ser、Arg的含量相對較多，Cys、Phe、Trp相對較少。不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為42.90，表明這個蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為95.97，總平均親水性為-0.214。親水性分析結(jié)果表明該蛋白質(zhì)是親水蛋白質(zhì)(圖4)。

2.3.2 Nsp5蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SOPMA服務(wù)器預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)骨架(圖5)組成包含：α-螺旋(h)占55.61%、β-折疊(t)占7.65%、無規(guī)則卷曲(c)占20.92%、延伸鏈(e)占15.82%。利用Phyre2.0蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器(使用Intensive選項)對Nsp5白質(zhì)進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，所得結(jié)構(gòu)有較多的α-螺旋和無規(guī)則卷曲(圖6)，結(jié)合圖5的結(jié)果，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測基本一致。

2.3.3 Nsp5蛋白質(zhì)B細(xì)胞表位預(yù)測

應(yīng)用ABCpred服務(wù)器對Nsp5蛋白的B細(xì)胞潛在抗原表位進行預(yù)測(閾值設(shè)定為0.51，窗口大小設(shè)定為16)，結(jié)果如表2： Nsp5蛋白共有15個潛在的B細(xì)胞抗原表位，其中41—56位aa得分最高(結(jié)果按得分降序排列，得分越高則意味著是目的肽段的可能性越大)，PEDV感染豬群的血清中可能存在特異性抗體。

3 討論

作為冠狀病毒復(fù)制啟始的主要蛋白酶，Nsp5不僅在病毒非結(jié)構(gòu)蛋白加工方面發(fā)揮重要作用，而且參與酶解宿主蛋白[15]、RNA結(jié)合以及病毒復(fù)制等過程[16-17]，Zhu等[18]報道豬流行性腹瀉病毒3C樣蛋白酶通過切割NEMO調(diào)節(jié)其干擾素β拮抗作用，因此一直被認(rèn)為是開發(fā)抗冠狀病毒藥物的有效靶標(biāo)[19]。本研究通過利用pET-28a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建并在E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)了PEDV/LY/2014/04分離株的重組His-Nsp5蛋白，利用生物信息學(xué)軟件分析該蛋白，為今后該病的診斷技術(shù)和免疫機制研究提供重要的基礎(chǔ)信息。

圖4 Nsp5蛋白質(zhì)的親水性與疏水性分析Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of Nsp5 protein

圖5 Nsp5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.5 Simulated secondary structure of protein Nsp5

圖6 Nsp5蛋白質(zhì)3D構(gòu)象預(yù)測Fig.6 Prediction of the 3D structure of protein Nsp5

表2PEDV/LY/2014/04分離株Nsp5的B細(xì)胞表位預(yù)測

Table2Prediction of B cell epitopes of PEDV/LY/2014/04 isolateNsp5

序號No.B細(xì)胞抗原表位潛在序列B cell epitope potential sequence位置Position/aa得分Score1HAMNVAKSEFDREAST41-560.952NARQQYEDAVNNGSPP18-330.863IWNIIDIKDNDGKVVH154-1690.854VGLPSYVIYENARQQY8-230.835TSDIDSYNRIQREGCV133-1480.826AAAQMYKEARAVNRKS67-820.817VVHVKEVTAQNAESLS167-1820.818DMSSVDTILNLAKDGV100-1150.819NRIQREGCVHYAGTIW140-1550.7810IKDNDGKVVHVKEVTA160-1750.7611VVSAMHSLLFGMLRRL84-990.7312DREASTQRKLDRMAEQ51-660.7313AESLSWPLVLGCERIV178-1930.7014DGVVPLSVIPAVSATK113-1280.6915GSPPQLVKQLRHAMNV30-450.58

運用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究方法，基因克隆、蛋白質(zhì)純化、晶體的篩選和晶體衍射數(shù)據(jù)的收集，構(gòu)建出病毒晶體結(jié)構(gòu)，是研究PEDV 3C樣蛋白酶結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵技術(shù)。St. John等[12]通過X射線晶體衍射的技術(shù)分析了3C樣蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，3C樣蛋白酶在空間群P212121中結(jié)晶為不對稱單元的二聚體。如人類冠狀病毒229E 3C樣蛋白酶[20]和SARS 3C樣蛋白酶[21]所報道的一樣，PEDV 3C樣蛋白酶是在每個單體中含有三個結(jié)構(gòu)域的同型二聚體，含有由殘基Cys144和His41形成的二元催化體系，其活性位點位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ之間的裂縫中，結(jié)構(gòu)域Ⅲ參與單體二聚化，其最終負(fù)責(zé)形成蛋白酶的活性[22]。正是因為研究者解析了該蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)展了許多3C樣蛋白酶抑制劑，很多抑制劑能有效抑制冠狀病毒的復(fù)制[19,23]。

PEDV的Nsp5基因序列比對分析表明，Nsp5基因是PEDV基因組中比較保守的區(qū)段，保證了其功能正確實施。PEDV的Nsp5分子質(zhì)量理論值為21 820.07 u，理論等電點(pI)為8.734；具有多個高親水性區(qū)域，屬于親水蛋白質(zhì)；SOPMA服務(wù)器(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)是常用的蛋白質(zhì)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)在線工具，該工具可以預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)序列中的復(fù)雜基序、構(gòu)建蛋白質(zhì)的3D模型，Nsp5則主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成；Phyre2.0蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi？id=index)主要用于蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，Nsp5則主要由螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成。ABCpred服務(wù)器(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)是采用機器學(xué)習(xí)算法，依賴于Bcipep數(shù)據(jù)庫，對固定長度的多肽進行B細(xì)胞表位預(yù)測，Nsp5蛋白共有15個潛在的B細(xì)胞抗原表位，原核表達(dá)產(chǎn)物可作為設(shè)計新型疫苗的靶標(biāo)，也可作為檢測PEDV病毒抗體的ELISA檢測方法的包被抗原，可以判定是否存在PEDV的感染。

本研究開展了Nsp5蛋白的原核表達(dá)，對其理化性質(zhì)、B細(xì)胞抗原表位、高級結(jié)構(gòu)預(yù)測方面進行了生物信息學(xué)分析，為Nsp5蛋白的研究提供了基本數(shù)據(jù)資料，可為后續(xù)深入探討Nsp5蛋白在豬流行性腹瀉病毒復(fù)制過程中的作用機理研究奠定一定的基礎(chǔ)，也為進一步開展PEDV的診斷技術(shù)及免疫學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。