劉祥辰 董慧玲 孔鵬洲 畢煬輝 賈軍梅 宋彬

食管癌是中國高發(fā)惡性腫瘤，每年新增病例約30 萬，組織學(xué)類型以食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主［1-2］。由于早期缺乏特異癥狀，就診時70%～80%患者已經(jīng)進(jìn)入臨床中晚期，總5年生存率在15%～25%之間［3］，Ⅲ期患者3年生存率僅10%，Ⅳ期患者3年生存率在5%左右［4］。目前，食管癌的治療方法主要為手術(shù)、化療、放療或多學(xué)科綜合治療［5］。盡管外科手術(shù)和綜合治療取得的進(jìn)步為ESCC 患者帶來生存獲益，但其預(yù)后仍不佳。經(jīng)典的聯(lián)合化療方案僅可使50%左右的患者得到緩解，其余患者仍對其不敏感，會產(chǎn)生原發(fā)性耐藥。即使對原方案敏感的患者，經(jīng)過2～3 個周期化療后又會出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［6-7］。此外，很多患者對化療藥物的耐藥性不僅表現(xiàn)為對已使用藥物的耐藥，而且對未使用的化療藥物也產(chǎn)生耐藥，即多藥耐藥性［8］，極大地影響了臨床療效。因此，闡明食管癌耐藥機(jī)制，克服化療耐藥尤其是多藥耐藥現(xiàn)象，對提高ESCC患者生存率具有重要意義。

鉑類抗腫瘤藥物包括順鉑（cisplatin，DDP）、奧沙利鉑（oxaliplatin，L-OHP）、奈達(dá)鉑（nedaplatin，NDP）等，是食管癌化療的常用藥物。伴隨其在臨床的廣泛應(yīng)用，越來越多的食管癌患者表現(xiàn)出對鉑類藥物的耐藥性［9］，已成為ESCC 化療失敗的重要原因。本研究通過建立人體外ESCC L-OHP耐藥細(xì)胞模型，探索其可能的耐藥機(jī)制和解決方法，為改善體外ESCC的耐藥現(xiàn)狀提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人體外ESCC 細(xì)胞系KYSE150 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；RPMI1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑、蛋白裂解液購自北京索萊寶公司；胰蛋白酶消化液、胎牛血清購自以色列Biological Industries（Bioind）公司；鼠抗人GAPDH 單抗、兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase，CDK4）、周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent ki?nase 6，CDK6）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）多抗購自武漢三鷹公司；鼠抗人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma，Rb）抗體，兔抗人磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（phospho-retinoblasto?ma，p-Rb）抗體購自上海CST公司；注射用L-OHP 購自山東齊魯制藥；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、紫杉醇（Paclitaxel，PTX）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；帕博西尼（palbociclib）購自上海Selleck Chemicals公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人體外ESCC 細(xì)胞KYSE150 置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，放置37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞狀態(tài)良好、80%融合度時進(jìn)行傳代，磷酸鹽緩沖液PBS 清洗1～2 次后，胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基消化終止，按1:4傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 耐藥細(xì)胞株KYSE150-OXA 的建立 取對數(shù)生長期的KYSE150 細(xì)胞，以10 倍半數(shù)抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50）為誘導(dǎo)劑量用LOHP 誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h，然后撤去含藥培養(yǎng)基，PBS 漂洗3次，加入正常完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每日PBS 清洗去除死細(xì)胞并更換新鮮培養(yǎng)基。1周后，培養(yǎng)基中間斷加入低濃度L-OHP（IC50 值的1/10～1/5 濃度）繼續(xù)培養(yǎng)。視細(xì)胞狀態(tài)重復(fù)上述加藥過程。誘導(dǎo)過程共歷時8 個月，最后得到耐藥細(xì)胞株KYSE150-OXA。SPSS 軟件計算藥物IC50 值，計算耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.3 CCK-8 法檢測藥物對KYSE150 和KYSE150-OXA細(xì)胞增殖的影響 選擇對數(shù)生長期的KYSE150及KYSE150-OXA 細(xì)胞，以5×104個細(xì)胞/孔的密度接種至96 孔板中，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，分別加入終濃度為0、4、8、16、32、64、128、200μmol/L的L-OHP；0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μg/mL 的PTX；0、100、400、800、1 600、3 200μmol/L的5-FU，處理各組細(xì)胞72 h，隨后每孔加入10%CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm 波長處各孔吸光度（optical density，OD）值，并計算藥物對細(xì)胞的抑制率：抑制率=（對照組-實驗組）/（對照組-空白組）。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 1）細(xì)胞周期：制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1～2×106/mL，70%乙醇4℃固定過夜。次日離心吸除固定液，加入1 mL 預(yù)冷的PBS 重懸清洗細(xì)胞，離心后棄上清。向沉淀中加入100μL RNaseA 混勻后，加入500μL 碘化丙啶（propidium io?dide，PI）染色液混勻，常溫孵育30 min，2 h 內(nèi)進(jìn)行流式檢測；2）細(xì)胞凋亡：制備單細(xì)胞懸液，以3×105個/孔的細(xì)胞密度鋪種于6孔板中，24 h 貼壁后，分別加入30μmol/L的L-OHP、0.3μg/mL的PTX、750μmol/L的5-FU共孵育48 h。胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集1×106個細(xì)胞，PBS 重懸清洗1 次，加入200μL 結(jié)合緩沖液重懸，再加入5μL Annexin V-FITC 輕輕混勻。加入5μL PI液混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，在1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 Western blot 收集細(xì)胞沉淀，PBS 清洗2 次，冰上裂解1 h，4℃、12 000 rpm離心15 min，收集上清，BCA 法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積并加入上樣緩沖液，100℃變性5 min，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，一抗4℃過夜。次日TBST洗膜4次，二抗室溫孵育2 h，曝光顯影。使用Image J 軟件分析圖像，以目的條帶和GAPDH 條帶灰度分析值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以表示，KYSE150與耐藥細(xì)胞KYSE150-OXA1、KYSE150-OXA2及KYSE50-OXA細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立人ESCC L-OHP耐藥細(xì)胞株

收獲L-OHP誘導(dǎo)2、5、8個月時的細(xì)胞KYSE150-OXA1、KYSE150-OXA2、KYSE150-OXA，CCK8檢測各組細(xì)胞對L-OHP的耐藥性。結(jié)果顯示：同親本KYSE150細(xì)胞相比，3組耐藥細(xì)胞株均表現(xiàn)出對L-OHP不同程度的耐藥（圖1A），耐藥指數(shù)分別為：2.59±0.26、5.10±0.11、11.23±0.59（圖1B），表明L-OHP耐藥細(xì)胞株建立成功。

由于多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞繼發(fā)性耐藥的主要形式，因此本研究分別檢測了耐藥細(xì)胞對PTX和5-FU的IC50值（表1），同親本相比耐藥細(xì)胞對5-FU耐藥指數(shù)2.26±0.23、PTX耐藥指數(shù)2.04±0.43。

圖1 ESCC L-OHP耐藥細(xì)胞株的建立

表1 PTX、5-FU IC50測定結(jié)果 （μM）

另外，本研究將L-OHP、PTX和5-FU處理48 h的細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行凋亡率檢測。結(jié)果顯示：與親本KYSE150細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞凋亡率明顯降低（表2）。提示除了對L-OHP耐藥之外，KYSE150-OXA細(xì)胞對PTX和5-FU耐藥。Western blot結(jié)果也顯示耐藥細(xì)胞株中多藥耐藥基因1（mul?tidrug resistance gene 1，MDR1）表達(dá)隨著藥物誘導(dǎo)濃度的增加而表達(dá)量上調(diào)，最高較親本細(xì)胞上調(diào)（4.46±0.22）倍（圖1C），表明耐藥細(xì)胞具有多藥耐藥性。

表2 藥物處理親本/耐藥細(xì)胞凋亡率的比較 （%）

2.2 KYSE150-OXA細(xì)胞周期變化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與親代KYSE150 細(xì)胞相比，KYSE150-OXA 細(xì)胞多處于G1期，S期與G2期細(xì)胞數(shù)目明顯減少（圖2A），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示L-OHP的耐藥機(jī)制與細(xì)胞周期異常密切相關(guān)。對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，隨著耐藥指數(shù)增加，耐藥細(xì)胞中CDK4、CDK6和CyclinD1的表達(dá)顯著升高，Cyclin E 表達(dá)明顯降低（圖2B），提示L-OHP 耐藥細(xì)胞株可能存在CDK4和CDK6的異常激活。

2.3 CDK4/6 抑 制劑palbociclib 逆 轉(zhuǎn)KY150-OXA 對L-OHP的耐藥性

為驗證CDK4/6 在KYSE150-OXA 耐藥機(jī)制中的作用，本研究根據(jù)L-OHP 作用于親本KYSE150 細(xì)胞的IC50 加入30μmol/L的L-OHP和不同濃度（5、10、20、30、40μmol/L）的palbociclib處理KYSE150和KYSE150-OXA細(xì)胞，計算IC50值后，應(yīng)用CompuSyn軟件計算出聯(lián)合用藥指數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)在palbociclib低濃度時，二者的聯(lián)合指數(shù)＞1，提示palbociclib與L-OHP起拮抗作用。后隨palbociclib濃度的增加，聯(lián)合指數(shù)則＜1（圖3A），提示二者逐漸轉(zhuǎn)為協(xié)同作用。

另外，加入20 μmol/L 的palbociclib 后，與未加palbociclib 組細(xì)胞相比，KYSE150-OXA 對L-OHP 的耐藥性顯著降低，且表現(xiàn)出隨palbociclib 濃度升高抑制率升高的趨勢（圖3B）。提示palbociclib 能夠逆轉(zhuǎn)KYSE150-OXA對L-OHP的耐藥性。

2.4 palbociclib 通過抑制CyclinD-CDK4/6-pRb 信號通路發(fā)揮作用

由于CDK4/6 抑制劑主要通過抑制CDK4/6 的激酶活性，使CyclinD-CDK4/6-pRb 信號通路抑制受阻，從而影響細(xì)胞周期正常進(jìn)行。因此，我們檢測了palbociclib 處理前后耐藥細(xì)胞KYSE150-OXA 中的cyclinD-CDK4/6-pRb 通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，palbociclib 處理組CDK4/6 的表達(dá)無顯著變化但pRb表達(dá)量降低（91±2）%以及其下游細(xì)胞周期蛋白CyclinA表達(dá)量降低（89±6）%（圖4A，4B），提示palbo?ciclib 可能通過抑制異常激活的CyclinD-CDK4/6-pRb通路逆轉(zhuǎn)L-OHP耐藥細(xì)胞的耐藥性。

圖2 KYSE150與KYSE150-OXA的細(xì)胞周期比較

圖3 palbociclib與L-OHP聯(lián)合使用效果

圖4 palbociclib 處理前后耐藥細(xì)胞中Cyclin D-CDK4/6-pRb 通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化

3 討論

鉑類藥物是臨床上最為常用的周期非特異性抗腫瘤藥物，其抗腫瘤原理是通過鉑原子與DNA 鏈上的G 堿基共價結(jié)合形成鏈內(nèi)及鏈間交聯(lián)，從而使DNA受損，復(fù)制受阻，引起腫瘤細(xì)胞凋亡［10］。在中國臨床腫瘤學(xué)會食管癌診療指南（2019 版）中，將鉑類聯(lián)合其他化療藥物作為ESCC 一線化療方案，而LOHP由于其較輕的胃腸道不良反應(yīng)，常用于晚期ES?CC 的化療方案中。隨著鉑類藥物在ESCC 治療中的廣泛應(yīng)用，越來越多的ESCC患者表現(xiàn)出對鉑類藥物的耐藥性。

為探究ESCC對L-OHP的耐藥機(jī)制，本研究建立了人體外ESCC L-OHP耐藥細(xì)胞株，最高耐藥指數(shù)達(dá)11.23±0.59，提示耐藥細(xì)胞系構(gòu)建成功。多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥的主要形式［11］，本研究結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株KYSE150-OXA表現(xiàn)出了對PTX和5-FU不同程度的耐藥性，MDR1 表達(dá)明顯升高，證實KYSE150-OXA 細(xì)胞株多藥耐藥性的存在。而進(jìn)一步的研究顯示，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株G1期細(xì)胞明顯增多，S期和G2期細(xì)胞明顯減少，提示耐藥性可能與細(xì)胞周期的改變有關(guān)。此外，耐藥細(xì)胞中CDK4、CDK6和Cyclin D1表達(dá)升高。Cyclin D是細(xì)胞周期蛋白家族的重要成員之一，在DNA合成前期（G1期）與CDK4/6結(jié)合并使其激酶活性激活，形成CDK4/6-Cyclin D 復(fù)合物。該復(fù)合物可使Rb 發(fā)生磷酸化，釋放與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，進(jìn)而使其活化，促進(jìn)DNA 合成期（S期）所需基因的轉(zhuǎn)錄［12］。CDK4/6的異常激活同多種腫瘤的增殖相關(guān)，約90%惡性腫瘤中存在Cyclin D1-CDK4/6-Rb 信號通路的異常［13］。ESCC耐藥細(xì)胞中CDK4、CDK6表達(dá)升高，提示二者可能在食管癌耐藥中發(fā)揮重要作用。

palbociclib是目前廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的CDK4/6特異性抑制劑，其主要作用機(jī)制是靶向抑制CDK4/6的活性，阻止腫瘤細(xì)胞過度增殖。其不僅可以單獨使用，也可與其他藥物聯(lián)用增強(qiáng)信號通路靶點抑制劑的效力［14］。有臨床研究結(jié)果顯示，乳腺癌中CDK4/6與PI3K 抑制劑［15］、激素受體拮抗劑來曲唑［16］聯(lián)用效果顯著；與mTOR、MEK、FGFR、BTK和RTK等靶點抑制劑聯(lián)用也有較好的臨床效果［14，17-18］。鑒于CDK4/6抑制劑的上述特點，本研究提出了CDK4/6 抑制劑palbociclib 與L-OHP 聯(lián)用可以逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對LOHP耐藥性的假設(shè)。結(jié)果顯示，加入palbociclib組的KYSE150-OXA 對L-OHP 的敏感性增加。而該作用的發(fā)揮可能是通過抑制CDK4/6 的激酶活性，使異常激活的Cyclin D-CDK4/6-pRb信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，使細(xì)胞周期恢復(fù)正常，阻止腫瘤細(xì)胞對化療藥的逃逸作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，低濃度的palbociclib 與L-OHP聯(lián)用會產(chǎn)生拮抗作用，但伴隨palbociclib的濃度增加，其與L-OHP 的協(xié)同作用逐漸增強(qiáng)，提示pal?bociclib的臨床使用必須規(guī)范，確保palbociclib達(dá)到一定程度的血藥濃度，使患者獲得最佳的治療效益。

本研究成功建立了人體外ESCC L-OHP 耐藥模型，并借助此模型發(fā)現(xiàn)，CDK4/6蛋白表達(dá)量在耐藥細(xì)胞中顯著升高。palbociclib 可能通過抑制異常激活的Cyclin D-CDK4/6-pRb 信號通路，逆轉(zhuǎn)人體外ES?CC L-OHP 耐藥細(xì)胞對L-OHP 的耐藥性。本研究為篩選具有抗腫瘤作用的化療方案，改善ESCC的耐藥提供了依據(jù)。