熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)[1]根據(jù)分子量分為不同家族,在蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到分子伴侶的作用。熱休克蛋白27(heat shock protein 27,Hsp27)[2-3]是其中一員,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生理過(guò)程;受到高溫、缺氧、藥物等刺激時(shí),表達(dá)誘導(dǎo)型Hsp27,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。有報(bào)道Hsp27參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等過(guò)程[2],其高表達(dá)與胸腺上皮腫瘤[4]、星形膠質(zhì)瘤[5]、食管腺癌[6]、肝癌[7]、涎腺腺樣囊性癌[8]、喉鱗狀細(xì)胞癌[9]、膀胱癌[10]及多發(fā)性骨髓瘤[11]預(yù)后不良相關(guān),但與食管癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]和肺癌[14]的良好預(yù)后相關(guān)。
神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)是起源于胚胎性交感神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)嵴的交感神經(jīng)胚胎性腫瘤,是兒童最常見(jiàn)的顱外實(shí)體腫瘤[15]。NB極易發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥,占兒童癌癥死亡率的15%[16]。根據(jù)國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理學(xué)分類(lèi)(INPC)[17-18],分為NB、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤(ganglioneuroblastoma,GNB)和節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤(ganglioneuroma,GN),其中GN為良性腫瘤,NB/GNB為惡性腫瘤。盡管使用手術(shù)、化療、放療、自體骨髓移植、生物制劑等多模式治療方案使NB患兒治療效果有所改善,但高?;純旱拈L(zhǎng)期生存率仍較低?;熕幬锬退幨歉呶;純褐委熓〉年P(guān)鍵原因之一,并且患者可能出現(xiàn)顯著的早期或晚期毒性,進(jìn)一步限制了常規(guī)化療劑量增強(qiáng)。近年研究表明,個(gè)體遺傳基因表達(dá)的差異及基因多態(tài)性是造成藥物反應(yīng)個(gè)體差異的主要原因[19],通過(guò)檢測(cè)藥物相關(guān)性分子靶標(biāo),能夠預(yù)測(cè)腫瘤化療藥物敏感性及毒副反應(yīng)。
因此,本研究首先檢測(cè)Hsp27在NB中的表達(dá),分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系;構(gòu)建耐藥細(xì)胞株,檢測(cè)Hsp27 表達(dá)差異;檢測(cè)常規(guī)化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo),以預(yù)測(cè)化療藥物的敏感性及毒副反應(yīng);進(jìn)一步分析Hsp27 的表達(dá)與藥物敏感性的關(guān)系,為評(píng)估NB/GNB的預(yù)后提供新指標(biāo),同時(shí)為NB/GNB尋找新的潛在的治療靶點(diǎn)。
1.1.1 病例資料 收集2012年4月至2019年5月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院確診神經(jīng)母細(xì)胞瘤新鮮切除的手術(shù)或手術(shù)活檢標(biāo)本。其中男性79 例,女性55 例,中位年齡3 歲(16 天至11 歲)。NB 分期、危險(xiǎn)度分組等參照2015 版《兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤診療專(zhuān)家共識(shí)》[20]。本研究通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查[(2017)年倫審(研)第(40)號(hào)],已獲得被研究對(duì)象或其家屬知情同意。
1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)、順鉑(購(gòu)自大連美侖生物公司MB1055)、胰蛋白酶(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)、CCK-8(購(gòu)自日本同仁公司)、RNA提取試劑盒(購(gòu)自中國(guó)Bio Teke 公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自日本TaKaRa公司)、TB Green Ⅱ熒光染料(購(gòu)自日本TaKaRa公司)、Hsp27引物(購(gòu)自上海生工生物公司)、β-acting引物(購(gòu)自上海生工生物公司)、兔Hsp27單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,ab2154)、免疫組織化學(xué)超敏二步法試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋公司)、DAB顯色試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋公司)、CFX96 Cycler熒光定量PCR儀(購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司)、顯微鏡(Nikon E800,分析軟件NIS-ELEMENtS br.3.0)。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人NB 細(xì)胞系SH-SY5Y 培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的DEME 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。采用低濃度長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)法干預(yù)SH-SY5Y:用完全培養(yǎng)基根據(jù)化療藥物的峰值血漿濃度(peak plasma concentration,PPC)(順鉑CDDP:3 μg/mL[21])配制培養(yǎng)基;從初始濃度0.1×PPC 開(kāi)始,以1.25~1.5 倍的梯度逐步提高化療藥物濃度,直至1×PPC濃度;每個(gè)濃度孵育24 h后,棄培養(yǎng)液,換用不含化療藥物的完全培養(yǎng)基,待其恢復(fù)生長(zhǎng)后,重復(fù)1次;反復(fù)換液、傳代,最終將細(xì)胞維持培養(yǎng)于含1×PPC濃度化療藥物的培養(yǎng)基中,常規(guī)凍存。
1.2.2 CCK-8法檢測(cè)耐藥性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后用完全培養(yǎng)基重懸為4×104/mL的細(xì)胞懸液,接種于96孔板,100μL/孔,培養(yǎng)24 h后,配制含CDDP的完全培養(yǎng)基,按照藥物的PPC稀釋成不同濃度梯度(0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 PPC),用含藥培養(yǎng)液置換孔中的培養(yǎng)液,設(shè)空白組、對(duì)照組,每個(gè)濃度重復(fù)3孔,培養(yǎng)48 h,棄孔中培養(yǎng)液,加入含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)液100μL,37℃孵育1~2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的OD值。細(xì)胞抑制率(%)=(OD空白孔-OD待測(cè)孔)/(OD空白孔-OD調(diào)零孔)×100%,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration,IC50),耐藥指數(shù)(resistance index,RI)=IC50(耐藥細(xì)胞)/IC50(親本細(xì)胞)。
1.2.3 RT-qPCR法檢測(cè)Hsp27基因mRNA的表達(dá) 采用離心柱法提取NB組織、親代及耐藥細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度,參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL,采用TB GreenⅡ熒光染料qPCR 法分別擴(kuò)增Hsp27cDNA(Forward 5'-CAAGGATGGCGTGGTGGAG ATC-3',Reverse5'-CTCGTTGGACTGCGTGGCTAG-3'),以人β-actin為內(nèi)參基因(Forward 5'-CCTGGCACCCAG CACAAT-3',Reverse 5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'),在CFX96 Cycler熒光定量PCR儀上運(yùn)行。每份標(biāo)本設(shè)定3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次;采用2-ΔΔCt法計(jì)算Hsp27基因表達(dá)水平。
1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NB組織中Hsp27蛋白的表達(dá) 石蠟包埋,連續(xù)組織切片,厚度為4.5μm,60℃烘烤后進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)脫蠟、檸檬酸鈉抗原修復(fù),3%H2O2室溫孵育阻酶,0.5%BSA 封閉,滴加兔Hsp27 抗體4℃過(guò)夜,經(jīng)免疫組織化學(xué)試劑盒反應(yīng)增強(qiáng)液和二抗依次作用后,DBA 顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封片后在光學(xué)顯微鏡下讀片。
結(jié)果判斷:Hsp27 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以胞核、胞質(zhì)棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性表達(dá)。染色范圍:整張切片內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞比例,陽(yáng)性細(xì)胞<25%為0分,25%~50%為1分,51%~75%為2分,>75%為3 分。染色強(qiáng)度:不顯色0 分,淡黃色1 分,棕黃色2分,棕褐色3分。染色范圍結(jié)合染色強(qiáng)度(染色范圍×染色強(qiáng)度=免疫組織化學(xué)結(jié)果)來(lái)判斷Hsp27 表達(dá)程度:0分(-),1、2分(+),3、4分(++),9、6分(+++)。
1.2.5 腫瘤標(biāo)本化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)檢測(cè) 18例NB/GNB 的石蠟包埋組織標(biāo)本送至上海復(fù)旦臨床病理診斷中心,分別采用IHC、PCR 擴(kuò)增測(cè)序法檢測(cè)常規(guī)藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)的表達(dá)或突變。
采用SPSS 23.0對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果用表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn);Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析生存及預(yù)后資料。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
通過(guò)低濃度長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)法,歷時(shí)5個(gè)月成功構(gòu)建耐順鉑細(xì)胞,命名SH-SY5Y/CDDP,耐藥指數(shù)>10倍(表1)。
表1 細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性比較
Hsp27在NB組織中陽(yáng)性率為72.22%(65/90),在GNB組織中陽(yáng)性率為37.5%(9/24),在GN組織中陽(yáng)性率為0(0/20),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.442,P<0.001,表2,圖1)。
在NB/GNB 組織中Hsp27 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期、危險(xiǎn)度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05),與患兒的年齡、性別、Shimada 組織學(xué)分型、N-myc 有無(wú)擴(kuò)增差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)?;熀蟮哪[瘤組織Hsp27表達(dá)較化療前增高6例,降低5例,無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,表3)。
表2 Hsp27蛋白與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例
RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,Hsp27 mRNA 在59 例NB/GNB 中表達(dá)量為3.763±1.854,在5 例GN 中表達(dá)量為2.476±0.698(P>0.05,圖2)。
Hsp27 mRNA 表達(dá)量在SH-SY5Y/CDDP 中 較SH-SY5Y 顯著增高(3.902±0.331vs.1.015±0.061,F(xiàn)=16.246,P<0.01,圖3)。
將NB組織中的Hsp27蛋白表達(dá)水平作為因變量繪制Kaplan-Meier 生存曲線(xiàn)(圖4),結(jié)果顯示Hsp27陰性表達(dá)患者的生存率(84.4±10.4)%明顯高于陽(yáng)性表達(dá)患者(70.0±7.9)%,χ2=4.22,P<0.05。
圖1 Hsp27在各組織中的表達(dá)(DBA染色×400)
表3 20例化療前后NB/GNB組織中Hsp27蛋白表達(dá)情況
圖2 Hsp27 mRNA在NB組織中的表達(dá)
圖3 Hsp27 mRNA在NB細(xì)胞中的表達(dá)
圖4 NB/GNB總體生存曲線(xiàn)
本研究共檢測(cè)18例NB/GNB腫瘤標(biāo)本的常規(guī)7個(gè)化療藥物敏感性分子靶標(biāo):ERCC1、TOPOⅠ、TOPOⅡA、MGMT、CYP2C19*2、CYP2B6*6、UGT1A1*28(表4)。分析Hsp27蛋白表達(dá)與化療藥物敏感性及毒性關(guān)系發(fā)現(xiàn)(表5),Hsp27蛋白在鉑類(lèi)化療藥物敏感性較低組的陽(yáng)性表達(dá)率61.5%(8/13)明顯高于敏感性較高組0(0/5),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.538,P<0.05),而Hsp27在環(huán)磷酰胺、伊立替康/拓?fù)涮婵?、蒽環(huán)類(lèi)/依托泊苷、替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性較高組與較低組及環(huán)磷酰胺、伊立替康/拓?fù)涮婵刀靖狈磻?yīng)較強(qiáng)組與較弱組的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表4 化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
表5 Hsp27表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系
本研究主要通過(guò)探討NB中Hsp27蛋白及基因水平的表達(dá)差異,分析找到NB 新的預(yù)后/診斷標(biāo)志物。結(jié)果顯示,Hsp27在NB/GNB腫瘤組織中高表達(dá),并與腫瘤分期、危險(xiǎn)度、轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān),可能參與NB/GNB 的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移,為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道Hsp27 與NB的關(guān)系。
Hsp27與腫瘤關(guān)系密切,諸多文獻(xiàn)已證明其與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展、參與治療耐受性及抑制細(xì)胞凋亡。但是這一結(jié)論在相同或不同腫瘤組織中報(bào)道不同。Nakajima 等[22]通過(guò)對(duì)62例食管鱗狀細(xì)胞癌樣本研究發(fā)現(xiàn),Hsp27高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度和病理分期呈負(fù)相關(guān),與淋巴結(jié)浸潤(rùn)呈正相關(guān)。但Kawanishi 等[23]研究認(rèn)為Hsp27的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤(rùn)深度和分期無(wú)關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)Hsp27在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)。Eto等[25]通過(guò)194例肝細(xì)胞癌樣本發(fā)現(xiàn)HSP27表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后無(wú)相關(guān)性,但對(duì)142例丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)陽(yáng)性組的分析發(fā)現(xiàn),磷酸化HSP27 陽(yáng)性的腫瘤直徑較大,門(mén)靜脈侵犯率較高。Liang等[7]研究發(fā)現(xiàn)Hsp27高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)病率、甲胎蛋白水平、病理分級(jí)呈正相關(guān),與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
國(guó)際上目前有兩項(xiàng)研究檢測(cè)了少量病例中NB的Hsp27 表達(dá),但國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。Ungar 等[26]通過(guò)對(duì)53例NB標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)Hsp27表達(dá)與臨床分期、N-myc 擴(kuò)增呈負(fù)相關(guān)。Zanini 等[27]通過(guò)對(duì)26 例NB/GNB標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)Hsp27表達(dá)與預(yù)后良好呈正相關(guān),與侵襲性呈負(fù)相關(guān)。與本研究關(guān)于該蛋白質(zhì)與NB的關(guān)系結(jié)論不一致,本研究認(rèn)為造成這種差異的原因主要為:1)用于評(píng)估Hsp27 的方法有關(guān),評(píng)估伴侶蛋白表達(dá)在腫瘤相關(guān)疾病預(yù)后作用的一個(gè)重要問(wèn)題是腫瘤細(xì)胞中磷酸化伴侶蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位信息欠明確;2)NB具有顯著異質(zhì)性及組織學(xué)多樣性,在同一NB 樣本中,通常包含不同程度成熟的區(qū)域,癌癥的不同區(qū)域呈非均勻蛋白質(zhì)表達(dá);3)另外兩項(xiàng)研究[26-27]均未探索Hsp27 在GN 中的表達(dá)情況,且樣本量較小,臨床病理參數(shù)隊(duì)列信息不完善;4)前兩項(xiàng)研究[26-27]患者來(lái)源分別為美國(guó)及意大利,均為歐美人種,本研究病例標(biāo)本來(lái)自中國(guó),患者均為亞洲人種;5)可能與Hsp27抗體有關(guān),Hsp27活性取決于其寡聚化、磷酸化狀態(tài)。具體差異原因仍需進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明。
有研究[2]報(bào)道受化療藥物刺激,Hsp27 表達(dá)應(yīng)激后增加。本研究比較了20 例化療前后NB/GNB 組織中Hsp27 的表達(dá)情況,隨著化療進(jìn)程,Hsp27 表達(dá)增高6 例(6/20),降低5 例(5/20),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與檢測(cè)樣本量較小相關(guān),后期將擴(kuò)大樣本量,驗(yàn)證該觀(guān)點(diǎn)。
有研究[28-29]表明Hsp27 參與腫瘤對(duì)化療的耐受性,如Hsp27 在耐5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的結(jié)腸癌細(xì)胞[30]、耐長(zhǎng)春新堿的胃癌[31]、耐吉西他濱的胰腺癌中高表達(dá)[32];抑制Hsp27可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療藥物的耐藥性[33],降低肺腺癌對(duì)吉西他濱敏感性[34],因此用適當(dāng)?shù)囊种苿┌邢騂sp27可能是理想的腫瘤治療靶點(diǎn)[35]。
本課題組前期研究[36-37]發(fā)現(xiàn),通過(guò)檢測(cè)藥物相關(guān)性分子靶標(biāo),可以預(yù)測(cè)腫瘤的化療藥物敏感性及毒副反應(yīng),根據(jù)檢測(cè)結(jié)果實(shí)施個(gè)體化化療方案能夠有效縮減瘤體,減少術(shù)前化療療程,減輕化療毒副反應(yīng)。本研究通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hsp27 mRNA表達(dá)在耐順鉑的細(xì)胞中比親代細(xì)胞高,說(shuō)明NB獲得性耐藥與Hsp27 有關(guān)。為進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證Hsp27 表達(dá)與耐藥的關(guān)系,本研究初步檢測(cè)18 例NB/GNB 常用化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo),預(yù)測(cè)其對(duì)藥物的敏感性及毒副反應(yīng),發(fā)現(xiàn)此18 例NB/GNB 對(duì)鉑類(lèi)、伊立替康/拓?fù)涮婵怠⑤飙h(huán)類(lèi)/依托泊苷、環(huán)磷酰胺、替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀的敏感性不高。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Hsp27表達(dá)增高與鉑類(lèi)藥物耐藥相關(guān),與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致,這為研究化療藥物耐藥靶點(diǎn)提供了新的思路,但仍需在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。
綜上所述,本研究通過(guò)初步探討神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及細(xì)胞中Hsp27 的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Hsp27 在NB/GNB高表達(dá),并與腫瘤分期、危險(xiǎn)度、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、鉑類(lèi)藥物耐藥相關(guān),可能參與了NB/GNB的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移耐藥。因此,本研究可能為NB的靶向治療尋求到新的標(biāo)志物,但仍需擴(kuò)大樣本量及進(jìn)一步基礎(chǔ)研究證明。