陽徐良，梁貴友

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 心血管外科,貴州 遵義 563099)

目前，體外循環(huán)(Cardio-pulmonary Bypass，CPB)技術是心臟外科心內直視手術所必需的技術手段，但是CPB術后心肌存在缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury ,MIRI)卻不容忽視。MIRI是指心肌經過一段時間的缺血缺氧再恢復血供時，心肌損傷非但沒有減輕或恢復，反而發(fā)生更為嚴重的心肌損傷。缺血預處理(IPC)、熱量限制、白藜蘆醇可以預防MIRI，以達到保護心肌的作用。這些心肌保護作用的機制是由一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ類組蛋白/非組蛋白去乙?；缚刂频?，這種去乙?；副环Q為沉默信息調節(jié)蛋白1(silence information regulator protein 1，SIRT1)[1-4]。SIRT1在心肌細胞內可使許多轉錄因子去乙?；?，包括叉頭蛋白(FOXO)轉錄因子、P53、核因子NF-κB、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α(PGC1-α)、過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ(PPAR-γ)、一氧化氮合酶(eNOS)等[5]，通過增強心肌細胞抗氧化應激能力、減輕炎癥反應、抑制心肌細胞凋亡與壞死、調節(jié)能量代謝、調節(jié)自噬、增強心肌舒縮功能，從而在MIRI中發(fā)揮重要作用，保護受損的心肌細胞。因此深入研究和挖掘SIRT1在MIRI中的保護機制十分必要，開發(fā)新的有效的SIRT1激動劑對于臨床預防和治療MIRI有著巨大作用。

1 MIRI的發(fā)生機制

隨著大量關于MIRI的發(fā)生機制的研究，目前一般認為是以下因素參與了MIRI的發(fā)生：①氧自由基(ROS)爆發(fā)：MIRI中ROS產生的主要來源有線粒體呼吸鏈途徑、黃嘌呤氧化酶途徑和花生四烯酸代謝途徑[6]，其中，線粒體被普遍認為是MIRI中ROS產生最主要的場所[7]。ROS的大量堆積使得心肌細胞膜上的脂質發(fā)生過氧化，心肌細胞的膜蛋白、酶功能以及活性進一步降低，心肌細胞的核酸和蛋白質發(fā)生交聯、變形，最終心肌出現可逆性損傷。②鈣超載：再灌注后，心肌細胞膜通透性增加，大量胞外Ca2+順濃度梯度內流(心肌細胞膜鈣漏)；缺血(缺氧)時心肌細胞能量代謝主要依靠糖酵解產生乳酸供能，Na+-K+ATP酶在缺血時停止轉運，因此MIRI后心肌細胞內乳酸堆積，細胞內酸中毒，胞內H+濃度驟增激活H+/Na+交換，使大量的Na+內流進而激活Na+/Ca2+交換，導致Ca2+內流，細胞內Ca2+積聚。Ca2+超載對心肌的損傷主要是導致線粒體的功能障礙，Ca2+能在線粒體內形成磷酸鈣鹽并沉積破壞線粒體結構和功能，抑制線粒體內的氧化磷酸化，導致ATP生成減少，并引起鈣依賴性的線粒體滲透性轉換孔(mPTP)持久性改變[8]。同時，鈣超載引起的線粒體損傷加劇ROS對心肌細胞的損傷。③線粒體損傷：線粒體已經成為缺血再灌注期間心肌損傷的關鍵靶點和組織損傷的根源。電子傳遞鏈(ETC)的損傷主要發(fā)生在心肌缺血期[7]。心肌I/R產生的ROS爆發(fā)、Ca2+超載導致早期線粒體驅動損傷，引起線粒體的異常滲透，線粒體膜電位喪失，抑制mPTP開放導致線粒體的腫脹和破壞，能量供應不足而壞死[9]。④炎癥：MIRI后中性粒細胞的粘附、激活，可釋放許多促炎因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-8(IL-8)以及彈性蛋白酶、黏附因子、膠原酶等幾十種蛋白水解酶與血管內皮細胞黏附，損傷心肌血管內皮細胞，導致無復流現象并介導該區(qū)域心肌細胞出現自噬、凋亡、壞死等[10]。⑤能量代謝異常：心肌細胞離子轉運、心肌收縮與舒張等過程皆需要消耗能量，依賴ATP的充足供應。而在心肌I/R期間，心肌能量來源從線粒體氧化代謝到糖酵解代謝的改變，以及糖酵解和葡萄糖氧化的解偶聯，導致心臟在I/R后出現低效率工作。同時，在心肌的I/R過程中，心肌出現胰島素抵抗現象(insulin resistance，IR)[11]，作為調節(jié)胰島素信號通路的經典途徑磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)[12]也被證實在I/R心肌IR中發(fā)揮重要作用，因此IR可能是MIRI發(fā)生的另一重要原因。

2 SIRT1的結構與分布、活性與調節(jié)

組蛋白的乙?；?去乙?；揎椩诨虮磉_調控中發(fā)揮著重要作用，隨著近年來對組蛋白乙?；揎椀纳钊胙芯?，已經證明了組蛋白去乙酰化與糖尿病、缺血性心肌病、先天性心臟病、肥胖等疾病密切相關，目前已知的組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)主要有四大類(見表1)，特別是其中的Ⅲ型HDACs(又稱sirtuins)更是受到了廣泛研究。哺乳動物的sirtuins家族蛋白分為7個亞型，SIRT1～7。Sirtuins作為細胞能量和代謝的傳感器，是一類依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ類組蛋白/非組蛋白去乙?；?。在過去的幾十年間，通過使用sirtuins激動劑、NAD+前體或過表達sirtuins，均發(fā)現了小鼠的器官功能得到改善并延長了壽命，Sirtuins的抗衰老作用越來越引起人們重視，其中的SIRT1仍然是研究熱點。人類SIRT1由500個氨基酸殘基組成，編碼基因位于染色體10q21.3(全長33660bp)，為單基因位點。SIRT1 mRNA(全長4101bp)包含8個內含子和9個外顯子，5’及3’端各有一個為53bp及1793bp的非翻譯區(qū)，編碼747個氨基酸(翻譯后蛋白質量為81.7KDa)[13]。SIRT1的催化結構域具有典型的Sirtuins折疊，正如Min發(fā)現的SIR2-Af1/NAD+復合結構一樣。催化核心由277個氨基酸殘基構成，由一大一小結構域組成，大小結構域之間形成一個裂隙，NAD+就結合在此并發(fā)生催化反應[14]。SIRT1在大范圍的組織和器官中表達，在人和小鼠的心臟、腦、肝臟、胰臟、肌肉和脂肪組織中檢測到，其中在腦組織、心臟中高水平表達[15]。

表1 HDACs分類及主要作用

分類 組成 主要作用ⅠHDAC1、2、3、8調節(jié)細胞膜表明酪氨酸激酶活性維持細胞表面環(huán)境相對平衡[16]ⅡHDAC4、5、6、7、9、10調節(jié)細胞病理性變化、抗氧化應激、抗炎癥[17]ⅢSirt1～7介導ADP核糖基化,可能在調節(jié)腫瘤、心血管病的發(fā)生中起作用[18]ⅣHDAC11可能具有獨特的細胞生化功能,與Ⅰ型類似[19]

從酵母到人類，細胞能量代謝的原理幾乎相同，都使用高度同源的途徑產生和消耗能量，并且使用通用的“能量貨幣”(ATP和NADH)來儲存和轉移能量。AMP激活蛋白激酶(AMPK)感測細胞低ATP水平；Sirtuins感測NAD+/NADH水平[20]。Sirtuins家族是保守的NAD+依賴性去乙酰化酶，作為細胞傳感器來檢測能量可用性和調節(jié)代謝過程，在多種細胞過程中起重要作用。對于代謝控制過程而言有兩種Sirtuin至關重要，其中最重要的是位于細胞核中的SIRT1，其具有乙?；富钚院虯DP-核酸轉移酶活性，依賴SIRT1的去乙酰化反應將蛋白質底物中賴氨酸上的乙?；D移給NAD+的ADP-核糖基部分，生成尼克酰胺(NAM)和2’-O-乙?；鵄DP-核糖，NAD+/NADPH和NAD+/尼克酰胺比例是調節(jié)SIRT1活性的主要機制。在小鼠缺血再灌注模型上通過外源性的靜脈給藥NAD+[21]，發(fā)現心肌梗死面積減少約85%，且NAD+保護作用呈劑量依賴性。而上述NAD+保護心肌的作用正是通過激活SIRT1實現的，但關于NAD+如何激動SIRT1發(fā)揮保護作用的機制還有待進一步研究。在迄今為止的大多數研究中，白藜蘆醇[22]已被用做SIRT1的有效激活劑。

3 SIRT1在MIRI中的作用機制

3.1 抗氧化應激 氧自由基(ROS)的爆發(fā)是MIRI的重要因素，提高ROS清除劑如錳超氧化物(MnSOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)能有效減輕氧化損傷。調控MnSOD、CAT、GPX表達的基因受叉形頭轉錄因子(FoxOs)調控，FoxOs轉錄因子在心肌細胞中高度保守，主要位于胞質中，在應激情況下，從細胞質轉移到細胞核中調控靶基因的表達。在哺乳動物中，FoxOs有四種成員：FoxO1、FoxO2、FoxO3a、和FoxO4，它們控制各種細胞過程，如細胞周期停滯、活性氧產生、DNA修復和細胞凋亡。越來越多的證據表明SIRT1去乙?；疐oxOs后上調FoxOs的轉錄活性，增加ROS清除劑的表達，減輕心肌細胞I/R的氧化應激損傷。小檗堿(Berberine，BBR)[23]和褪黑素受體[24]可通過激活SIRT1，上調心肌超氧化物歧化酶(SOD)水平，降低心肌超氧化物、NADPH氧化酶(Gp91PHOX)、丙二醛的表達，而這些保護作用可被SIRT1抑制劑(Stnl)抑制。與此同時，在H9C2細胞的I/R模型中，SIRT1通過去乙?；疐oxO1和FoxO3，誘導FoxOs的核易位，促進ROS清除劑的表達增加，從而達到清除ROS的作用，減輕心肌細胞的氧化損傷[25]。Mingge等[26]利用SIRT1腺病毒轉染技術過表達SIRT1，調節(jié)I/R大鼠的eNOS活性來減少心肌I/R損傷。亦有報道[27]指出，SIRT1還可通過激活PGC-1α減輕氧化損傷，同時上調雷帕霉素不敏感伴侶(RICTOU)的轉錄，觸發(fā)Akt/FOXO磷酸化級聯反應，激活雷帕霉素靶蛋白復合體2(mTORC2)信號。相反，SIRT1缺乏的小鼠中表現出mTORC2信號傳導受損，ROS產生增加。此外在糖尿病大鼠中進行MI/R手術時發(fā)現SIRT1的活化上調核因子E-2-相關因子 (nuclearfactor erythroid-2-related factor,Nrf)- 血紅素加氧酶-1 (hemeoxygenase-1，HO-1)介導的抗氧化信號通路減輕心肌損傷[28]。以上證據表明，SIRT1在保護心肌免受氧化應激損傷的過程中作用顯著，為我們提供了潛在的治療靶點。

3.2 抑制凋亡 P53是調節(jié)細胞周期和凋亡中的關鍵調控因子，在心肌細胞核中SIRT1將P53蛋白第382位賴氨酸殘基去乙?；痆29]，降低其與DNA順式作用元件的結合能力來抑制其轉錄活性，減弱對下游信號通路的激活作用，抑制促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表達[35]，同時上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，以此減少心肌細胞凋亡[30]。小鼠I/R模型[24]的研究結果表明，SIRT1的抗凋亡作用還能通過FoxO1的去乙?；瘜崿F，而這些抗凋亡作用可被SIRT1的特異性抑制劑EX527或SIRT1 siRNA抑制而消除。SIRT1對FoxO1的去乙?；饔糜兄p向性：一方面，FoxO1的去乙?；T導細胞周期基因表達，如DNA修復基因(GADD45)、p27KIP、氧化應激抵抗基因(MnSOD)；另一方面，抑制誘導凋亡基因的活性，包括BIM和Fas，這種雙面影響促使心肌細胞在應激情況下存活率增高。由此可見，通過SIRT1-FoxO1信號通路減輕MIRI具有多種調節(jié)方式，而絕非僅僅是增強或者減弱FoxO1活性。

內質網在缺血、缺氧等不良刺激的影響下，可出現內質網內未折疊或錯誤折疊蛋白的堆積，引起內質網應激(ERS)。內質網應激相關凋亡已被證參與了MIRI的形成，并且其不同于傳統(tǒng)的死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑，它是一種新的細胞凋亡途徑。在基因敲除小鼠(SIRT1-/-)[31]中發(fā)現PDI和CHOP(ER水平的標志蛋白)蛋白水平分別增加了1.6倍和1.5倍；同時，在用SIRT1抑制劑處理的H9C2心肌細胞中，出現較高的ERS和心肌細胞凋亡，通過添加SIRT1激活劑可以改善這些作用。有研究發(fā)現大蒜素[28]在糖尿病小鼠I/R模型中通過激活SIRT1，能抑制由蛋白激酶類RNA內質網激酶(PERK)/真核起始因子2α(eIF2α)/轉錄激活因子4(ATF4) / CHOP介導的ERS，而這種保護作用同樣能被EX527抑制。有趣的是，當SIRT1被抑制或遺傳缺失時，不僅eIF2α乙?；酱蟠笤黾樱琫IF2α的磷酸化水平也在ERS時增加，表明這兩種翻譯后修飾調節(jié)方式之間存在動態(tài)的相互作用[32]，但其相互作用的機制還未見報道。但也有人通過小劑量的衣霉素(經典ERS誘導劑)上調心肌組織的熱休克蛋白(GRP78，可反映ERS水平)的表達，激活適度的ERS反而能減輕MIRI。因此，如何控制ERS的激活水平，以及選用合適的激動靶點及藥物是研究難點。

3.3 減輕炎癥反應 炎癥與MIRI密切相關，心肌缺血再灌注過程中大量的白細胞浸潤在心肌組織中，釋放多種細胞因子加劇心肌損傷，但其調控機制不甚清楚，最新的研究[33]顯示，NOD樣受體熱蛋白結構域3(NLRP3)炎性體作為人類固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在MIRI的炎癥損失機制中扮演者重要角色，它能激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase1)，導致促炎細胞因子IL-1β、IL-18加工和分泌。有研究報道[34]，白藜蘆醇預處理能顯著降低大鼠I/R梗死面積和心肌纖維化，下調NLRP3和Csapase1的表達和IL-1β、IL-18的活化。同時，Li等[35]認為血管內皮細胞不僅是血液與血管壁之間的屏障，而且也可以作為先天免疫細胞。他們觀察到脂多糖(LPS)和ATP觸發(fā)了人臍靜脈血管內皮細胞NLRP3的激活，同時出現SIRT1表達降低；而SIRT1激活劑可抑制NLRP3炎性小體的活化，SIRT1敲除明顯增強NLRP3的活化。最重要的是，SIRT1基因沉默消除了SIRT1激動劑對NLRP3活化和Caspase1分泌的抑制。這些表明NLRP3炎性小體的激活有可能受SIRT1調節(jié)。但是對于NLRP3的激活機制一直是眾說紛紜，有文獻[36]認為炎癥小體由SIRT1-TLR4/NF-κB途徑激活，還有文獻報道ROS、Ca2+、ESR都能作為第一激活條件。最有趣的是，Jong等[37]在NLPR3基因敲除小鼠I/R模型中發(fā)現，心肌梗死面積較野生型無明顯差異。并且Sandanger等[38]發(fā)現下調NLRP3的表達，心肌梗死面積反而擴大。這些結果的不同，可能與動物模型之間炎癥反應程度不同以及心肌損傷的指標存在差異有關。因而尚不能排除NLRP3炎性小體在MIRI中有雙面性，這種作用是否依心肌損傷程度和細胞類型的不同而不同，亟待進一步探討。

3.4 與自噬的關系 在心肌I/R過程中除了引起心肌的凋亡和壞死外，還出現心肌細胞的自噬現象。當葡萄糖剝奪時，胞質內甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的Ser122位點被活化的AMPK磷酸化后轉移入核內，與SIRT1發(fā)生直接相互作用引發(fā)自噬。為了評估SIRT1在介導自噬中的作用，用Ad-SIRT1、Ad-sh-SIRT1和Ad-FoxO1、Ad-sh-FoxO1轉染心肌細胞，證實SIRT1和FoxO1協同作用是誘導自噬必需的[39]。FoxO1被抑制或敲除后[40]，許多自噬相關基因(如：Atg4b、Atg12、Pik3c3、Becnl、Mapllc3b)下調，同時通過升高SESN3/Sesns3的表達水平抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性，抑制自噬。然而目前關于自噬對MIRI影響仍有不清楚和爭議，主要是有以下兩個方面：①心肌細胞I/R存在自噬的階段性，缺血期，增強自噬可促進細胞存活；而在再灌注時，自噬進一步增強卻對細胞有害？②心肌缺血誘發(fā)的自噬是依賴AMPK的，而在再灌注時卻是由Beclin1調控。而另一觀點則認為缺血抑制mTOR誘發(fā)自噬，再灌注期是由于自噬對mTOR具有負反饋調節(jié)，防止自噬過度引起細胞死亡。正是由于自噬調節(jié)機制的復雜性以及自噬在MIRI中作用的不確定性，未來要確定的是激活自噬在MIRI中到底是起損傷還是保護作用？深入研究缺血和再灌注期兩個階段的靶點及藥物選擇，這樣才能更好的發(fā)揮心肌內源性的保護作用。

3.5 改善能量代謝 正常情況下，心肌細胞的能量供應來源于脂肪酸(60%～90%)和葡萄糖(10%～40%)。在缺血缺氧時，心肌為了適應有限的氧氣供應，優(yōu)化能量供應比例以保證細胞存活。因此，缺血上調葡萄糖的攝取和糖原分解，下調線粒體的脂酸氧化。同時，細胞對改變能量底物供應作出的調節(jié)是促使葡萄糖轉運蛋白(GLUT-4)表達和轉位，脂肪酸轉運蛋白(FAT/CD36)則相反[41]，因此增加心肌葡萄糖的利用可改善能量供應，有助于心肌功能恢復。心肌I/R后，出現胰島素抵抗現象，伴有GLUT-4表達下降和轉位障礙，導致細胞外的葡糖糖不能很好的進入胞內被利用，胰島素生理作用降低。正因如此，作為治療糖尿病的經典藥物羅格列酮，在心肌缺血再灌注損傷中能明顯改善胰島素抵抗現象[42]。同時，通過si-RNA沉默缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)[43]和PPARγ[44]，均發(fā)現沉默組較之模型組，GLUT-4表達及轉位障礙更加明顯，胰島素抵抗程度加重，心肌細胞死亡率增高；而SIRT1可以通過脫乙?；疕IF-1α[45]和PPARγ[27]來改善缺血缺氧損傷。那么心肌I/R后SIRT1是否通過PPARγ或者HIF-1α來調控GLUT-4的表達和轉位？以及如何調控？這些都尚未見報道，值得進一步研究。

同時，線粒體作為心肌細胞能量底物氧化代謝的場所，在調節(jié)能量代謝方面也相當重要。Ma等[46]觀察到在糖尿病小鼠體內出現胰島素抵抗、葡萄糖代謝異常、線粒體受損，而這些改變可被白藜蘆醇逆轉；隨后，在慢病毒轉染的小鼠和特異性SIRT1敲除(SIRTKO)小鼠中均發(fā)現H9c2心肌細胞凋亡比例增高、線粒體膜電位降低、線粒體復合物Ⅳ酶活性降低、ATP生成減少，而這些似乎都與SIRT1通過PGC-1α的去乙?；?、調節(jié)下游蛋白NRF-1、NRF-2、ERR-α和TFAM來改善線粒體動力學有關。同時在其他人的研究[22，47]中也證實了這一結果，還有報道發(fā)現SIRT1能抑制線粒體自噬保護心臟免受I/R損傷[48]，這也印證了MIRI各發(fā)生機制之間相互聯系，牽一發(fā)而動全身。上述機制總結見圖。

圖1 SIRT1在心肌缺血再灌注中的作用通路

4 展望

越來越多的證據表明SIRT1可以保護心臟免受衰老和缺血性損傷，刺激內源性SIRT1表達似乎有希望成為降低I/R損傷水平的治療方向。然而，SIRT1在心臟中的作用仍有許多未解決的問題，主要有以下幾個方面：①SIRT1的保護作用是呈劑量依賴性，輕度/過度表達均不能有效保護心臟免受I/R損傷，高水平的表達甚至是有害的[5]。因此，必須確定SIRT1的最佳表達水平，以達到最大的治療效果。②NAD+/NADH在心臟中的調節(jié)機制尚未完全了解。Sirtuins和NAD+之間的偶聯以及SIRT1與心臟線粒體和其他NAD+消耗酶(如Poly[ADP-核糖]聚合酶1)之間的相互作用還需進一步研究。③SIRT1通過對關鍵轉錄因子如PPARγ和PGC-1α的脫乙?；挠绊懸约癝IRT1介導的葡萄糖和脂肪酸代謝變化對I/R損傷的影響還有待闡明。④闡明SIRT1相關的下游靶點有助于開發(fā)更有效的藥物來保護心臟免受I/R損傷。可見，想要更加透徹的了解SIRT1在心臟細胞生物學中的作用，將其轉化為治療心肌缺血性損傷有價值的靶點，還有很長的路要走。