黃銀浩，陳永艷，王寶仁

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099； 2.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院 皮膚科，貴州 畢節(jié) 551700)

尖銳濕疣(Condyloma acuminata，CA)是由人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV) 感染引起的臨床常見性傳播疾病，多見于肛周及泌尿生殖器等部位，目前認(rèn)為CA的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的免疫功能特別是由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫抑制密切有關(guān)，但確切機(jī)制尚不完全清楚[1]。有研究發(fā)現(xiàn)Tregs細(xì)胞在CA細(xì)胞免疫抑制中起重要作用[2-4]。本課題采用免疫組織化學(xué)方法檢測Foxp3和IL-10在CA皮損中的表達(dá)，探討Tregs細(xì)胞在CA局部細(xì)胞免疫抑制中可能的作用，為減少CA的發(fā)病及復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2016年7月至2017年7月在我院皮膚性病門診初診且未治療的30例尖銳濕疣患者，均符合CA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，其中男17例，女13例；年齡20～56歲，平均(31.4±11.1)歲；病程0.5～3個月，平均28d，所有患者6個月內(nèi)未使用過免疫調(diào)節(jié)劑并排除感染性疾病、自身免疫性疾病、嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病和妊娠。15例為在我院泌尿外科行包皮切除術(shù)的健康男性的正常包皮組織(正常對照組)，年齡19～40歲，平均(25.4±9.2)歲。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人Foxp3多克隆抗體和IL-10多克隆抗體分別購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司和北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Maxvision法免疫組化試劑盒為Dako公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制備 所有標(biāo)本首先用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，除1張做HE染色外，其余均做免疫組化染色。

1.3.2 HE染色 置于60 ℃烤箱內(nèi)烘烤切片，分別采用二甲苯、梯度酒精脫蠟至水后染色進(jìn)行封片，最終完成鏡檢。

1.3.3 免疫組化染色 常規(guī)脫蠟、水化，F(xiàn)oxp3采用 pH=9.0的EDTA微波加熱15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，IL-10則采用pH=6.0的0.01%檸檬酸鹽高壓鍋煮沸后保壓3 min抗原修復(fù)，室溫下自然冷卻后采用Maxvision二步法：一抗 4 ℃孵育過夜，滴加二抗37 ℃孵育30 min，切片經(jīng) DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，封片。Foxp3和IL-10一抗工作濃度為1∶100。扁桃體組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.3.4 結(jié)果判斷 Foxp3 、IL-10均以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選5個400倍視野的陽性表達(dá)區(qū)域采用Olympus相機(jī)在固定條件下采圖。采用圖像分析軟件測量每張圖片平均積分光密度(IOD)和總測量面積(Area)，然后用OD值=IOD/Area進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 正常包皮及尖銳濕疣皮損HE染色結(jié)果(見圖1)。

A：正常對照組；B：尖銳濕疣組； IHC×100。圖1 IHC下兩組HE染色結(jié)果

2.2 Foxp3在尖銳濕疣皮損和正常對照組中的表達(dá) Foxp3陽性細(xì)胞主要位于真皮層，正常對照組觀察到少量Foxp3+淋巴細(xì)胞(見圖2A)，尖銳濕疣組均能見到大量Foxp3+淋巴細(xì)胞(見圖2B)。尖銳濕疣組較正常對照組對比發(fā)現(xiàn)Foxp3+淋巴細(xì)胞在尖銳濕疣組的表達(dá)明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見表1，圖2)。

組別 例數(shù)Foxp3tP正常對照15 0.016±0.02038.020<0.001尖銳濕疣30 0.201±0.084?

*：與對照組比較，P<0.001。

A：正常對照組；B：尖銳濕疣組； IHC×400。圖2 IHC下觀察兩組Foxp3陽性細(xì)胞

2.3 IL-10 在尖銳濕疣皮損和正常對照組中的表達(dá) IL-10陽性細(xì)胞主要位于真皮層，正常對照組觀察到少量IL-10陽性細(xì)胞(見圖3A)，尖銳濕疣組均能見到大量IL-10陽性細(xì)胞(見圖3B)。IL-10陽性細(xì)胞的表達(dá)在尖銳濕疣組中明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見表2，圖3)。

組別 例數(shù)IL-10tP正常對照15 0.021±0.00564.916<0.001尖銳濕疣30 0.206±0.091▲

▲：與對照組比較，P<0.001。

A：正常對照組；B：尖銳濕疣組； IHC×400。圖3 IHC下觀察兩組IL-10陽性細(xì)胞

2.4 Foxp3與IL-10表達(dá)的相關(guān)性 尖銳濕疣皮損中Foxp3與IL-10的表達(dá)存在正相關(guān)(r=0.873，P<0.01)，見圖4。

圖4 尖銳濕疣皮損中Foxp3和IL-10相關(guān)性分析

3 討論

機(jī)體局部或全身細(xì)胞免疫功能低下是造成病毒持續(xù)感染、復(fù)發(fā)以及惡變的主要原因，CA局部細(xì)胞免疫功能在其發(fā)病及復(fù)發(fā)中起重要作用[6]，感染HPV后可通過多種機(jī)制使機(jī)體細(xì)胞免疫受到抑制而逃脫免疫監(jiān)視，但導(dǎo)致CA細(xì)胞免疫抑制的機(jī)制目前尚不完全清楚。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的CD4+T細(xì)胞亞群[7]，通過分泌IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子抑制T、B細(xì)胞的活化及IL-2的產(chǎn)生，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答方面具有重要作用。在病毒感染性疾病中，Tregs細(xì)胞具有平衡作用，不僅可以抑制過度免疫反應(yīng)造成的組織損傷，還抑制某些病原體感染宿主而發(fā)揮有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，不利于宿主對病原體的清除，因此Tregs細(xì)胞數(shù)量和功能異常與病毒感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3)是Tregs細(xì)胞最特異的分子標(biāo)記，也是其生長發(fā)育和發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵[9]。成熟小鼠或人類Tregs細(xì)胞缺失Foxp3將失去其抑制能力，同時增強(qiáng)組織炎癥反應(yīng)，提示Foxp3持續(xù)表達(dá)對Tregs細(xì)胞的穩(wěn)定是必需的[10]，同時Foxp3能促進(jìn)潛在HPV的復(fù)活[11]。對Tregs在CA 患者外周血中的研究表明，CA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs數(shù)量增加，F(xiàn)oxp3mRNA表達(dá)水平升高[2,12]，提示CA患者存在全身細(xì)胞免疫抑制并與外周血Tregs數(shù)量增加相關(guān)。有資料表明，CA患者皮損中Foxp3的陽性表達(dá)率明顯高于正常包皮組織[13-14]，提示Tregs在CA局部細(xì)胞免疫抑制中可能也起重要作用[15]。IL-10是由Tregs細(xì)胞分泌的一種具有廣泛免疫效應(yīng)的細(xì)胞因子[4]，有抑制細(xì)胞免疫和抵抗炎癥反應(yīng)兩大作用，可抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞等釋放促炎因子，對樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞等的生成與分化具有調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)它們分化為Tregs細(xì)胞[16]。有研究發(fā)現(xiàn)CA患者皮損組織中IL-10mRNA的表達(dá)水平高于正常人對照組[17]。為進(jìn)一步闡明CA局部細(xì)胞免疫抑制的可能發(fā)生機(jī)制，我們采用免疫組織化學(xué)Maxvision方法檢測CA患者皮損中Tregs細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和抑制性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，結(jié)果顯示CA皮損中Foxp3和IL-10的表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，且Foxp3與IL-10的表達(dá)存在正相關(guān)(P<0.001)。我們推測，HPV感染人體后可在感染局部組織誘導(dǎo)Tregs細(xì)胞的活化及增殖，使皮損局部Tregs增多，導(dǎo)致IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子分泌增加，激活免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)節(jié)，抑制了機(jī)體局部針對HPV的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致CA皮損局部存在明顯細(xì)胞免疫抑制，從而使HPV能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視而長期存在及復(fù)發(fā)。