肖志中，韓 光，周 娟，陳旭義，王振國，張景童，劉 洋

(1.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心 泌尿外科，天津 300162；2.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心 腦科中心，天津 300162；3.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心 醫(yī)教部，天津 300162；4.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院 二大隊，天津 300309；5.上海市第四人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，上海 200000)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占成人惡性疾病的2%～3%，是男性常見腫瘤的第7位，女性常見腫瘤的第10位[1]，且RCC的發(fā)病率會隨人口年齡的增長而進一步上升[2]。目前，世界衛(wèi)生組織將RCC分為透明細胞癌、乳頭狀細胞癌以及嫌色細胞癌。其中，75%～90%為透明狀細胞癌，10%～15%為乳頭狀細胞癌，4%～5%為嫌色細胞癌[3]。定位于染色體10q23上的PTEN基因可以抑制多部位癌細胞的增殖[4]。PTEN可以介導(dǎo)蛋白的磷酸化作用，3,4,5-三磷酸脂酸肌醇(phosphatidylinositol-3 kinase，PIP3)是PTEN的最常見的底物。PIP3是細胞內(nèi)信號通路的第二信使，D3位點上被PTEN磷酸化后可以直接抑制PI3K的活性，參與PI3K/AKT信號通路的負性調(diào)節(jié)[5]。PIP3/PI3K-AKT信號通路主要調(diào)節(jié)細胞的新陳代謝、細胞增殖和細胞遷移，并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著至關(guān)重要的作用。腫瘤的發(fā)生，通常會引起PTEN的功能紊亂、變異或者沉默，造成PI3K/AKT信號通路的活化。先前的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤產(chǎn)生的藥物耐受性，也很可能是因為PTEN的功能紊亂而導(dǎo)致的[6]，PTEN的功能紊亂同時也會顯著提高腫瘤入侵和遷移能力。本實驗就卡博替尼對腎透明細胞癌的治療作用進行了探索，為卡博替尼的臨床應(yīng)用提供了一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI-1640(80002)、胎牛血清(FBS)(10100147)、高糖DMEM培養(yǎng)基(H-DMEM)(11995065)、GultaMax(25030081)購自Gibco公司；盤尼西林-鏈霉素混合試劑(P1400)、MTT試劑盒(M1020)購自索萊寶生物科技公司；EcoRI(R0101L)、XhoI(R0146L)購自NEB公司；Hieff Trans脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑(40802ES01)、G418購自翊圣生物公司；Cabozantinib(S1119)、SF1670(S7310)購自Selleck公司；動物組織/細胞RNA提取試劑盒(CW0584)、HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒(CW2569)、Super TaqMan一步法熒光定量PCR試劑盒(CW2695)購自康為世紀公司；SUCLG2(ab187996)、ACO2(ab110321)、p53(ab26)、Bcl-2(ab692)、BAX (ab182733)、增殖細胞核抗原(PCNA)(ab29)、AKT(ab8805)、p-AKT(ab38449)、mTOR(ab2732)、p-mTOR(ab109268)抗體購自Acam公司；786-O細胞(TCHu186)購自中科院上海典藏細胞庫。

1.2 載體構(gòu)建 通過聚合酶鏈反應(yīng)獲得PTEN的cDNA，所用引物序列為：上游引物5’-CGGAATTCGGATGTCCCGAAAGCAGG-3’；下游引物：5’-CCGCTCGAGTCAGATGTTGAGCGG-3’。PCR產(chǎn)物和pCDA3.1 -3×Flag載體用EcoRI和XhoI進行雙酶切，酶切后的引物片段及載體進行過夜連接以構(gòu)建pCDA3.1 -3×Flag-PTEN過表達質(zhì)粒。按照Hieff Trans脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑說明書，將pCDA3.1 -3×Flag-PTEN過表達質(zhì)粒載體及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入786-O細胞，通過1 000 μg/mL的G418篩選穩(wěn)定表達的786-O細胞。

1.3 細胞培養(yǎng)和分組 于37 ℃，5% CO2環(huán)境下使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)786-O細胞。將786-O細胞分為6組：對照組(NC)，卡博替尼處理組(NC+C)，PTEN抑制劑組(PI)，卡博替尼處理合并PTEN抑制劑組(PI+C)，PTEN過表達組(PO)以及卡博替尼合并PTEN過表達組(PO+C)組。分別用5 μM，10 μM和20 μM卡博替尼處理NC+C、PI+C和PO+C細胞24 h，篩選合適濃度的卡博替尼在后續(xù)實驗中對細胞進行處理，實驗前使用無菌PBS清洗，移除殘留的卡博替尼。

1.4 MTT實驗檢測各組細胞存活率 參照之前的研究進行MTT實驗[7]。細胞接種于96孔板上，每孔接種密度控制在1×104左右。當(dāng)細胞融合度達到80%～85%時，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的卡博替尼。加藥24 h后，使用無菌的PBS清洗細胞去除多余的卡博替尼。加入MTT使其終濃度為5 mg/mL，繼續(xù)孵育4 h。孵育結(jié)束后，終止培養(yǎng)，加入DMSO，選擇560 nm波長，在全波長酶標儀上測定各孔光吸收值，每組各做3個復(fù)孔計算細胞生存率。細胞生存率=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 按照動物組織/細胞RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取實驗。細胞裂解后在室溫下靜置孵育5 min，隨后在12 000 rpm離心5 min。向溶液中加入乙醇，并將混合物轉(zhuǎn)移至吸附柱，12 000 rpm離心1 min，使RNA與吸附柱結(jié)合。清洗緩沖液清洗吸附柱后，用無RNA酶水洗脫RNA。洗脫后得到的溶液用ND-2000分光光度計測量RNA的濃度。取相同量的RNA進行反轉(zhuǎn)錄實驗。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)混合物，混合物于42 ℃反應(yīng)15 min，隨后與85 ℃反應(yīng)5 min，即得到cDNA。

1.6 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測p53、BAX和Bcl-2基因的表達量 qPCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃，30 s；變性95 ℃，5 s；退火55 ℃，30 s以及延伸72 ℃，30 s，進行40個循環(huán)。循環(huán)閾值(CT)根據(jù)擴增后的熒光信號進行計算設(shè)置。2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[8]。GAPDH作為內(nèi)參，并以GAPDH為標準，對目的基因表達進行定量。每組實驗均獨立重復(fù)3次，擴增引物序列見表1。

表1引物序列

基因名引物名稱引物擴增長度BCL-2上游引物5’-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3’415bp下游引物5’-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3’BAX上游引物5’- TGCAGAGGATGATTGCTGAC-3’316bp下游引物5’-GAGGACTCCAGCCACAAAGA-3’p53上游引物5’-TCCTCCCCAACATCTTATCC-3’501bp下游引物5’-GCACAAACACGAACCTCAAA-3’GAPDH上游引物5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’283bp下游引物5’-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’

1.7 Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路、凋亡相關(guān)蛋白和三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶的表達量 蛋白提取前，用預(yù)冷的PBS清洗每組的細胞樣品，隨后使用RIPA裂解緩沖液裂解細胞。裂解后樣品于12 000 rpm離心10 min，收集上清，并通過BCA實驗確定蛋白樣品濃度。每組取相同量的蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，用半干法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至0.22 μm的硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h， SUCLG2、ACO2、p53、Bcl-2、BAX、PCNA、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR一抗(1∶1 000稀釋)于4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，與室溫下羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育1 h。ECL發(fā)光法檢測目的蛋白的表達，Scion Image軟件對條帶的灰度值進行分析。GAPDH作為內(nèi)參對目的蛋白進行均一化處理。

2 結(jié)果

2.1 卡博替尼對786-O細胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，卡博替尼抑制786-O細胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)的影響(見圖1)。加藥5 μM卡博替尼24 h后，細胞生存率為(90.3±4.86)%，在10 mg/mL卡博替尼實驗組，細胞生存率為(73.60±3.12)%，在20 μM卡博替尼實驗組中，生存率降為(52.4±2.1)%。通過實驗數(shù)據(jù)，可得在加藥濃度為10 μM和20 μM實驗組中，卡博替尼顯著地抑制了786-O細胞的生存率(P<0.05)。因此，我們擬定使用10 μM卡博替尼進行后續(xù)實驗，在此濃度下卡博替尼在抑制786-O細胞生存率同時多數(shù)細胞依然可以存活。

2.2 AKT/mTOR信號通路中分子表達水平 各組中p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的比值如圖2所示。NC+C組及PI+C組與其對應(yīng)的對照組相比，其p-AKT/AKT比值并無顯著差異。PO+C組與對照組及PO組相比其p-AKT/AKT比值顯著降低(P<0.05)。p-mTOR/mTOR在各組中的比值呈現(xiàn)出于p-AKT/AKT類似的變化趨勢。卡博替尼處理后，各組p-mTOR/mTOR表達量均出現(xiàn)下降。與PI組相比，PI+C組中p-mTOR/mTOR比值顯著降低(P<0.05)。而PO+C組中p-mTOR/mTOR的比值對比NC組顯著降低(P<0.05)。

MTT實驗顯示卡博替尼對于786-O細胞增殖的影響，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(n=3)。*：與相應(yīng)對照組相比P<0.05；#：與NC組相比P<0.05。圖1 卡博替尼對于786-O細胞增殖的影響

A：Western blotting檢測AKT，p-AKT，mTOR和p-mTOR的表達水平; B:細胞內(nèi)p-mTOR/mTOR比值的定量分析；GAPDH作為Western blotting分析的內(nèi)參(n=3)；C：細胞內(nèi)比值的定量分析。*：與相應(yīng)對照組相比P<0.05；#：與NC組相比P<0.05。圖2 卡博替尼對于AKT/mTOR信號通路的影響

2.3 凋亡相關(guān)分子表達的變化 如圖3所示，對比NC組，在NC+C組中p53的表達量略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異。PI組中p53的表達與NC組相比顯著降低(P<0.05)，PI+C組中p53的表達與PI組相比顯著增加而與NC組相比顯著降低(P<0.05)。PO組及PO+C組中p53表達與NC組相比無明顯改變。此外，卡博替尼處理會增加BAX的表達量，PI+C組及PO+C組中，與對應(yīng)的對照組相比出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。與NC組相比，PI及PI+C組中BAX的表達量顯著降低(P<0.05)，而PI+C組中BAX表達量則顯著增加(P<0.05)。此外，NC+C組以及PO+C組中BCL-2的表達量與其對應(yīng)對照組相比顯著降低(P<0.05)，PO組中BCL-2表達量與NC組相比出現(xiàn)顯著降低(P<0.05，見圖4)。

A：Western blotting檢測p53，BAX和Bcl-2的表達量；B：p53表達水平的定量分析；C：Bcl-2表達水平的定量分析；D：BAX表達水平的定量分析；GAPDH作為Western blotting分析的內(nèi)參(n=3)。*：與相應(yīng)對照組相比P<0.05；#：與NC組相比P<0.05。圖3 Western blotting檢測卡博替尼對凋亡相關(guān)分子表達水平的影響

A：細胞內(nèi)p53基因相對表達量；B：細胞內(nèi)BAX基因相對表達量；C：細胞內(nèi)Bcl-2基因相對表達量。*：與相應(yīng)對照組相比P<0.05；#：與NC組相比P<0.05。 圖4 qPCR檢測卡博替尼對于凋亡相關(guān)分子基因水平表達量的影響

2.4 卡博替尼處理后糖代謝相關(guān)分子表達水平 卡博替尼處理后，AOC2和SUCLG2的表達水平變化(見圖5)。與對應(yīng)的對照組相比，在NC+C和OP+S組中ACO2的表達顯著上升(P<0.05)，同時，對比NC組，在PI，PI+P和PO組中ACO2的表達量也呈顯著增加(P<0.05)。然而，SUCLG2的表達水平出現(xiàn)不同的趨勢。在NC+P，PI+P和PO+P組中，卡博替尼明顯的抑制了SUCLG2的表達(P<0.05)，而對比NC組，PO和PO+P組中SUCLG2表達量也顯著下降(P<0.05)。

A：ACO2和SUCLG2的Western blot電泳結(jié)果；B：ACO2相對定量；C：SUCLG2相對定量。*：與相應(yīng)對照組相比P<0.05；#：與NC組相比P<0.05。 圖5 卡博替尼對于786-O細胞中TCA循環(huán)關(guān)鍵酶的影響

3 討論

RCC是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，已逐漸上升至第九大癌癥病因[9]。在腎細胞癌的3種亞型中，將近95%是透明細胞癌，其5年生存率僅為74%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，患者的年齡、腫瘤TNM分級與RCC的預(yù)后密切相關(guān)[10]。此次研究構(gòu)建了PTEN表達抑制及PTEN過表達的細胞，并且通過實驗發(fā)現(xiàn)，卡博替尼通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路和糖代謝來抑制786-O細胞的增殖，從而引起786-O細胞的凋亡最終起到抗腫瘤效應(yīng)。同時發(fā)現(xiàn)，PTEN可能會增強卡博替尼對于透明細胞癌的作用，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。

PTEN是一種腫瘤抑制基因，通過控制細胞磷脂酸酶的活性來調(diào)節(jié)細胞的增殖從而達到抑制腎細胞癌、乳腺癌和前列腺癌細胞生長的作用[11]。PTEN的磷酸酶活性大部分聚集在其碳端區(qū)域，其磷酸化能夠改變PTEN的亞細胞定位，而PTEN活性位點的變異以及脂磷酸酶活性喪失與癌癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系[12-14]。因此，本次實驗針對細胞內(nèi)PTEN位點進行改造，以觀察PTEN對藥物治療作用的影響。PI3K/PTEN/AKT信號通路與細胞的生長密切相關(guān)，信號通路的功能紊亂或者異常都會引起細胞的異常生長，最終引起腫瘤的發(fā)生[15]。大量癌癥細胞中均發(fā)現(xiàn)PIK3/AKT信號通路的活化，這一信號通路與癌癥細胞的持續(xù)生長和不良預(yù)后相關(guān)。PI3K/AKT的下游分子mTOR的活性與癌癥細胞的發(fā)展也密切相關(guān)。此前的研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR的表達通過抑制細胞中的自噬作用，大大提高藥物的抗腫瘤效應(yīng)[16]。此次研究中，卡博替尼作用細胞后，PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性受到明顯的抑制，這一趨勢在PTEN過表達模型中更加顯著，抑制PTEN表達將會削弱這一作用。實驗結(jié)果表明，卡博替尼通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性，抑制腫瘤細胞的增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。PTEN過表達則會進一步增強卡博替尼對腫瘤細胞的抑制作用，發(fā)揮協(xié)同作用。

Bcl-2家族和p53都是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，在細胞凋亡的調(diào)節(jié)過程中有著重要的作用。BAX和Bcl-2都是Bcl-2家族的成員，BAX，Bcl-2和p53也是PIK3/AKT/mTOR信號通路下游分子，在細胞凋亡過程中起到重要的作用。在正常組織中，p53執(zhí)行多種功能，包括細胞周期調(diào)節(jié)，細胞穩(wěn)態(tài)維持以及細胞凋亡。但p53的變異會誘導(dǎo)癌癥發(fā)生，超過50%癌癥患者體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子p53發(fā)生了變異。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，p53的表達在人體癌變組織中經(jīng)常被抑制[17]。因此，p53被認為是一種抑癌基因。PTEN可以與p53直接相互作用，通過Mdm2抑制p53的降解，進而增強p53的表達[18]。此外，p53可以直接激活PUMA的表達活性，PUMA在Bcl-2同源物3(BH3)域上與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，誘導(dǎo)BAX的表達[19]。此次研究結(jié)果顯示，卡博替尼處理細胞后會在基因和蛋白水平增加細胞內(nèi)p53的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖，當(dāng)PTEN過表達后，會進一步放大這種效應(yīng)，而PTEN表達抑制后則會減弱這一效應(yīng)。BAX屬于Bcl-2家族，也是一種腫瘤抑制蛋白，在細胞自身凋亡過程中起著重要的作用[20]。BAX定位于線粒體外膜上，在外界促凋亡刺激因子及p53作用下被激活和移位，是誘導(dǎo)細胞凋亡起始的重要環(huán)節(jié)[21]。BAX可以促進線粒體中細胞色素C的釋放，并且活化多種細胞凋亡蛋白酶，誘發(fā)腫瘤細胞中的凋亡過程。此次研究結(jié)果表明，卡博替尼可以從蛋白和轉(zhuǎn)錄水平增加BAX的表達，且過表達PTEN將會增強這一趨勢，抑制PTEN將會減弱這一趨勢，從而促進腫瘤細胞的凋亡。Bcl-2是Bcl-2家族中抗細胞凋亡蛋白，在人體腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族中例如Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡基因的表達上調(diào)[22]。Bcl-2的過表達不僅與腫瘤細胞發(fā)生和延續(xù)密切相關(guān)，同時也與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥型有著密切的關(guān)系[23]。卡博替尼處理后會在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平降低Bcl-2的表達量， PTEN的過表達則會加強這一效應(yīng)，進而減弱細胞內(nèi)的抗凋亡進程，促進腫瘤細胞的凋亡。上述結(jié)果表明，卡博替尼可以活化細胞凋亡過程并且抑制抗細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，引起腫瘤細胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。PTEN過表達會增強這一作用，而PTEN表達敲低則會減弱這一作用。

快速增殖是腫瘤細胞的基本特征，為了維持腫瘤細胞新陳代謝的需要，新陳代謝過程將會發(fā)生變化，加大葡萄糖的攝取和優(yōu)先利用是其重要的特征之一[24-25]。三羧酸循環(huán)是細胞內(nèi)糖類化合物轉(zhuǎn)換成能量的關(guān)鍵步驟，參與許多生理學(xué)進程。近期研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞中的TCA循環(huán)是與正常細胞不同，谷氨酰胺等非糖類化合物均可用來供給能量，以滿足其代謝的需求[26]。由此我們推測，卡博替尼的抗腫瘤作用可能與TCA循環(huán)相關(guān)分子表達量的改變有關(guān)，從而影響腫瘤細胞內(nèi)的有氧氧化過程。ACO2和SUCLG2是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶。ACO2通過中間產(chǎn)物順烏頭酸可逆催化檸檬酸生成異檸檬酸，SUCLG2是琥珀酰輔酶A合成酶的亞基，可以可逆催化琥珀酰輔酶A和琥珀酸酯的形成?？ú┨婺釋τ谶@兩種酶的作用呈現(xiàn)相反的趨勢，作用細胞后，出現(xiàn)ACO2的表達的上調(diào)和SUCLG2的表達的下調(diào)。在PTEN過表達后，上述作用得到進一步增強，而PTEN表達抑制后上述作用則被削弱。上述結(jié)果表明，卡博替尼的抗腫瘤作用可能與其抑制腫瘤細胞TCA循環(huán)關(guān)鍵酶，進而減少腫瘤細胞的能量供應(yīng)，誘導(dǎo)細胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，PTEN表達的增加則會增強卡博替尼的抗腫瘤作用。

此次研究中發(fā)現(xiàn)，卡博替尼通過抑制腫瘤細胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性以及腫瘤細胞內(nèi)TCA循環(huán)關(guān)鍵酶的活性，抑制細胞的有氧氧化過程，減少細胞功能，進而在誘導(dǎo)促凋亡蛋白表達的同時抑制抗凋亡蛋白的表達，最終誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。而PTEN過表達后，卡博替尼的抗腫瘤作用得到了增強，在PTEN表達降低后，卡博替尼的抗腫瘤作用出現(xiàn)了減弱，表明PTEN的表達與卡博替尼的抗腫瘤作用可能存在協(xié)同效應(yīng)，有可能成為未來治療ccRCC的新策略。