袁 杰，王斯瑋，余守洋，姚 剛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 疼痛科暨麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 種植科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；4.安順市人民醫(yī)院 疼痛科，貴州 安順 561000)

阿霉素(adriamycin,ADM)是一種臨床常用抗腫瘤抗生素，有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性。阿霉素能損害周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，尤其是脊髓背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)和自主神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元[1]。目前臨床常用于損毀神經(jīng)節(jié)來治療三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛等神經(jīng)病理性疼痛[2]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可選擇性地對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆變性、壞死作用[3-4]。但蛛網(wǎng)膜下腔注射阿霉素是否會對肢體感覺和運(yùn)動功能產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步研究。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)的主要目的是觀察在蛛網(wǎng)膜下隙注射0.4 mL阿霉素后，觀察阿霉素對家兔后肢運(yùn)動及感覺功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與儀器 阿霉素(分子量543.52，萬樂藥業(yè)，深圳)；蒸餾水(Millipore，美國)；JL-F光熱測痛儀(2411013，明克斯儀器，上海)；生物光學(xué)顯微鏡(BX43，Olympus，日本)；小動物手術(shù)器械包(SP0004-M，瑞沃德，深圳)；全自動熱痛刺激儀(BME-410C，凱輝盛達(dá)科技發(fā)展有限公司，北京)、電子測痛儀(Electronic Von Frey，IITC公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性家兔24只，SPF級，體重1.5～2 kg，由第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號：SCXK(渝)2012-0005]。所有動物均飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)“貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”SPF級動物房。動物房內(nèi)室溫維持在22～25 ℃，08∶00～20∶00開燈，20∶00～次日08∶00關(guān)燈，動物可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)化飲食和飲水。動物飼養(yǎng)和操作遵循世界動物保護(hù)協(xié)會和國際疼痛研究學(xué)會相關(guān)規(guī)定，并獲得遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 分組 將家兔隨機(jī)分為2組，每組6只，NS組：蛛網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水(0.4 mL)； ADM組：蛛網(wǎng)膜下腔注射濃度為1%的阿霉素(0.4 mL)。

1.3.2 后肢運(yùn)動和感覺功能評價

1.3.2.1 后肢運(yùn)動功能評價 術(shù)前及術(shù)后1～8周每周評價后肢運(yùn)動功能[1]。在寬闊場地觀察家兔自發(fā)活動。0級：無后肢運(yùn)動，無負(fù)重；1級：幅度微弱的后肢運(yùn)動，無負(fù)重；2級：后肢較強(qiáng)有力,有輕微運(yùn)動,無負(fù)重；3級：后肢可負(fù)重，可行走1至2步；4級：輕微跛行；5級：正常行走。

1.3.2.2 后肢感覺功能評價 機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold， MWT):將家兔置于底部均勻分布大小0.5 cm × 0.5 cm孔徑的透明玻璃籠中。適應(yīng)30 min后，利用von Frey測痛儀垂直刺激家兔左后肢足掌部，刺激力度以von Frey絲輕微彎曲為準(zhǔn)，持續(xù)5 s或直至出現(xiàn)縮足反應(yīng)。出現(xiàn)縮足反應(yīng)記為陽性，否則視為陰性。采用up-and-down法[5]計(jì)算50%縮足閾值(MWT)，縮足閾值=最大值-(最大值-最小值)/[最大值×(最大百分比-50%)]。測定時間為阿霉素注射前1周至注射后8周，每天上午08∶00-10∶00。

熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)：參照之前文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6]，家兔適應(yīng)環(huán)境30 min后，使用熱痛刺激儀，輻射熱對準(zhǔn)小鼠左足掌正中照射，自動記錄縮足反應(yīng)的潛伏期作為熱痛閾。每只家兔測定3次，取3次平均值作為熱痛縮足閾值(TWL)。測定時間為每天下午15∶00～17∶00。所有觀察和記錄均在雙盲條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 ADM蛛網(wǎng)膜下腔注射對家兔運(yùn)動功能的影響 與注射前比較，家兔在注射生理鹽水1和2周后，分別有25%(3/12)和16.7%(2/12)出現(xiàn)輕微跛行。阿霉素注射1和2周后，分別有33%(4/12)和25%(3/12)出現(xiàn)輕微跛行。1和2周出現(xiàn)跛行的陽性率兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3～8周兩組家兔后肢運(yùn)動功能未見異常(見表1)。

表1家兔后肢出現(xiàn)跛行的陽性率

組別后肢跛行陽性率注射前注射后1周注射后2周 NS03(25%)?2(16%)?ADM04(33%)#3(25%)#

*：與NS組注射前比較，P<0.05；#：與ADM注射前比較，P<0.05。

2.2 ADM蛛網(wǎng)膜下腔注射對家兔MWT的影響 2組家兔MWT基礎(chǔ)閾值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。生理鹽水組注射前后，MWT值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與注射前對比，ADM組注射后1、2、3周MWT值明顯降低(P<0.05)，4～8周MWT值明顯增加(P<0.05，見表2)。

2.3 ADM蛛網(wǎng)膜下腔注射對家兔TWL的影響 2組家兔TWL基礎(chǔ)閾值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。生理鹽水組注射前后，TWL值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。同上，ADM組注射后1、2、3周TWL值明顯降低(P<0.05)，4～8周TWL值明顯增加(P<0.05，見表3)。

表2家兔蛛網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水或阿霉素前后的MWT變化

組別基礎(chǔ)痛閾術(shù)后1周術(shù)后2周術(shù)后3周術(shù)后4周NS43.89±3.4241.48±4.7742.79±3.2741.91±3.9439.88±3.39ADM42.73±4.2727.43±3.64?#29.33±4.39?#26.96±4.38?#62.74±3.77?#續(xù)表組別基礎(chǔ)痛閾術(shù)后5周術(shù)后6周術(shù)后7周術(shù)后8周NS43.89±3.4242.49±3.2141.53±2.9642.58±3.7741.43±4.27ADM42.73±4.2764.33±4.29?#61.27±3.25?#59.57±4.29?#2.44±4.21?#

*：ADM與注射前比較，P<0.05；#：ADM與NS組比較，P<0.05。

表3家兔蛛網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水或阿霉素前后的TWL變化

組別基礎(chǔ)痛閾術(shù)后1周術(shù)后2周術(shù)后3周術(shù)后4周NS18.32±3.8717.43±2.4519.23±3.1117.85±4.4519.51±2.49ADM19.61±2.999.34±4.89?#8.32±3.74?#11.47±3.92?#39.33±3.51?#續(xù)表組別基礎(chǔ)痛閾術(shù)后5周術(shù)后6周術(shù)后7周術(shù)后8周NS18.32±3.8717.83±2.8718.45±2.9220.27±3.3719.73±3.48ADM19.61±2.9942.69±3.59?#41.67±3.54?#39.98±2.98?#41.62±4.39?#

*：ADM與注射前比較，P<0.05；#：ADM與NS組比較，P<0.05。

3 討論

阿霉素可抑制RNA和DNA的合成，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性[7]。是近年來廣泛用于治療三叉神經(jīng)痛等神經(jīng)病理性疼痛的一種神經(jīng)毀損藥物。目前的研究認(rèn)為，阿霉素主要通過兩種途徑對組織細(xì)胞造成損傷：①促進(jìn)有害羥自由基的產(chǎn)生及膜脂質(zhì)過氧化；②能嵌入DNA堿基對，通過阻止轉(zhuǎn)錄過程，抑制RNA合成，從而阻止DNA的復(fù)制[8]。此外，阿霉素可被神經(jīng)纖維末梢吸收并沿軸漿逆行性運(yùn)輸(lethal retrograde axoplasmic transport)和自殺性運(yùn)輸(suicide transport)[9]。阿霉素還對背根神經(jīng)節(jié)(DRG)有較高的親和性[10]，前期研究發(fā)現(xiàn)脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元對阿霉素的敏感性和易損性不同于DRG，并且小劑量的阿霉素還對DRG具有選擇性破壞作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)后肢運(yùn)動功能檢測結(jié)果顯示，家兔蛛網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水1和2周后，分別有25%(3/12)和16%(2/12)的家兔出現(xiàn)跛行。注射阿霉素后1周和2周后，分別有33.3%(4/12)，25%(3/12)的家兔出現(xiàn)跛行。注射生理鹽水及阿霉素后跛行陽性率較于注射前出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，NS組和ADM組比較陽性率未見明顯差異(P>0.05)。據(jù)此，我們認(rèn)為注射1～2周后造成的跛行與阿霉素注射沒有相關(guān)性，可能是蛛網(wǎng)膜下腔注射對局部肌肉組織造成的創(chuàng)傷所導(dǎo)致。

本實(shí)驗(yàn)感覺功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，家兔蛛網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水后，1～8周機(jī)械縮足閾值(MWT)未見明顯差異(P>0.05)；注射阿霉素后，1～3周MWT明顯低于注射前，4～8周明顯高于注射前。家兔蛛網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水后，1～8周熱縮足潛伏期(TWL)未見明顯異常(P>0.05)；注射阿霉素后，1～3周TWL明顯低于注射前，4～8周明顯高于注射前。實(shí)驗(yàn)表明，注射阿霉素1～3周，家兔后肢MWT及TWL值均出現(xiàn)明顯降低，可能與DRG細(xì)胞受損初期出現(xiàn)興奮性增強(qiáng)及痛覺過敏有關(guān)[12]。注射阿霉素后4～8周，MWT及TWL值出現(xiàn)明顯增高，表明阿霉素蛛網(wǎng)膜下腔注射可能導(dǎo)致了DRG壞死。家兔在蛛網(wǎng)膜下腔注射阿霉素4周后出現(xiàn)痛閾值升高，可能與DRG細(xì)胞壞死需要一定的時間有關(guān)。之前的病理實(shí)驗(yàn)報(bào)道了注射后4周DRG細(xì)胞出現(xiàn)明顯壞死[13-14]，我們的感覺功能檢測結(jié)果與病理實(shí)驗(yàn)相符。這一結(jié)果提示蛛網(wǎng)膜下腔注射阿霉素治療頑固性的神經(jīng)病理性疼痛時，常需要4周以上的時間才能判斷阿霉素注射的鎮(zhèn)痛效果，應(yīng)避免在短時間內(nèi)重復(fù)多次注射。

DRG是軀體和內(nèi)臟感覺的重要傳入通路，在多種神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持過程中扮演關(guān)鍵的角色。我們的研究證實(shí)，家兔選擇性的損毀相應(yīng)節(jié)段的DRG，后肢痛閾在注射4周后明顯增高，而運(yùn)動功能不受影響。阿霉素蛛網(wǎng)膜下腔注射可達(dá)到化學(xué)切除DRG的目的，這一方法較于外科手術(shù)切除DRG，可減少手術(shù)伴隨的并發(fā)癥[15]。這一方法有望對臨床治療頑固性病理性神經(jīng)病理性疼痛提供一新思路。