張永恒， 常廷民

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1.藥學部； 2.消化科，河南 衛(wèi)輝 453100

二甲雙胍是臨床上治療2型糖尿病的常用藥物，除了有降糖作用外，其還可通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡對卵巢癌、結(jié)腸癌和非小細胞肺癌等多種腫瘤表現(xiàn)出較好的抗腫瘤作用[1-3]。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是一種前列腺素過氧化物合成酶，其在乳腺癌、膠質(zhì)瘤和胰腺癌等多種腫瘤組織中異常高表達，可通過誘導細胞增殖、抑制細胞凋亡和促進血管生成等促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-6]；已有研究[7-8]報道指出，COX-2在胃癌組織中異常高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和5年生存率等有關(guān)，抑制其表達可有效提高胃癌的治療效果。塞來昔布是一種COX-2選擇性抑制劑，因其靶向作用強和不良反應(yīng)小等優(yōu)點在抗腫瘤方面?zhèn)涫荜P(guān)注。近年來有研究[9]報道，二甲雙胍和塞來昔布兩藥聯(lián)用可起到協(xié)同抗胰腺癌的作用，但兩者聯(lián)合應(yīng)用是否有更好的抗胃癌價值尚未可知。本研究以人胃癌SGC-7901細胞為研究對象，通過二甲雙胍和塞來昔布單獨或聯(lián)合用藥探討其抗腫瘤的分子機制，以期為胃癌的藥物治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器RPMI 1640購自美國GIBCO公司，新生胎牛血清購自杭州四季青，胰蛋白酶購自美國BIOBASICI公司，MTT試劑和二甲雙胍購自美國Sigma公司，COX-2選擇性抑制劑塞來昔布購自美國輝瑞公司。Cyclin D1抗體購自美國BD公司，PCNA抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋生物公司，β-actin抗體、全蛋白抽提試劑盒、Braford蛋白含量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL檢測試劑盒均購自南京凱基生物公司，PI細胞周期檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自美國BD公司，PVDF膜購自美國PALL公司，酶標儀購自美國BIO-RAD公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Stratagene公司，CO2細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。

1.2細胞培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞購自美國ATCC。采用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于濕度95%、溫度37 ℃和體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測收集長勢良好的對數(shù)生長期SGC-7901細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，制備濃度為5×105ml-1的細胞懸液，以每孔100 μl接種至96孔細胞板上，常規(guī)培養(yǎng)過夜。加入終濃度為5、10、15、20和25 mmol/L 二甲雙胍或終濃度為20、40、80、100和120 μmol/L 塞來昔布，并以不加藥物處理的細胞作為對照。每個處理組設(shè)置5個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入濃度為5 g/L的MTT試劑20 μl作用4 h，棄培養(yǎng)液后，加入150 μl二甲基亞楓，震蕩反應(yīng)20 min。選取490 nm檢測波長，以酶標儀檢測每孔的吸光度(OD)值。以無細胞的培養(yǎng)液作為空白調(diào)零組，按照存活率(%)=100%×(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)計算各組細胞的存活率。每組細胞重復(fù)檢測3次。后期實驗：取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，以常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將其分為4組：對照組(未加藥)、二甲雙胍組(加入濃度為10 mmol/L二甲雙胍)、塞來昔布組(加入濃度為100 μmol/L塞來昔布)和聯(lián)合組(加入濃度為10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來昔布)，按照分組給予處理72 h后，采用MTT法檢測各組細胞的存活率。

1.4流式細胞儀檢測取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，以每孔2×105個細胞接種至6孔細胞板上，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將其隨機分為對照組、二甲雙胍組、塞來昔布組和聯(lián)合組，按照1.3中的處理方式分別給藥作用72 h后，收集各組細胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，分別參照細胞周期檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細胞的周期變化及凋亡率。

1.5Westernblotting檢測收集給藥作用72 h的對照組、二甲雙胍組、塞來昔布組和聯(lián)合組細胞，根據(jù)全蛋白抽提試劑盒說明書提取總蛋白，并以Braford法檢測總蛋白的濃度。將經(jīng)沸水浴處理后變性的蛋白樣品，以每孔60 μg上樣至質(zhì)量濃度為120 g/L SDS-PAGE凝膠孔中進行電泳。待電泳分離結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)質(zhì)量濃度為50 g/L 脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h后，依次加入一抗(4 ℃，24 h)和二抗(37 ℃，1 h)孵育。待充分作用后，避光條件下加入ECL試劑顯影，最后采用圖像分析儀掃描分析。

2 結(jié)果

2.1二甲雙胍和塞來昔布單用對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響二甲雙胍和塞來昔布均能夠呈濃度-時間依賴性抑制SGC-7901細胞增殖(P<0.05)。10 mmol/L 二甲雙胍和100 μmol/L塞來昔布在72 h時，SGC-7901細胞的細胞存活率接近IC50值(見表1、表2)。故后期選用10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來昔布聯(lián)合作用72 h進行實驗。

表1 不同濃度的二甲雙胍對SGC-7901細胞增殖的影響Tab 1 Effect of Metformin with different concentrations on the proliferation of SGC-7901 cells %

注：與0 mmol/L相比，aP<0.05。

表2 不同濃度的COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對SGC-7901細胞增殖的影響Tab 2 Effects of different concentrations of COX-2 selective inhibitor Celecoxib on proliferation of SGC-7901 cells %

注：與0 mmol/L相比，aP<0.05。

2.2二甲雙胍和塞來昔布單用或聯(lián)合對SGC-7901細胞增殖的影響與對照組相比，10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來昔布均可使SGC-7901細胞在G0/G1期所占百分比增加，S期百分比減少(P<0.05)，但二甲雙胍對G2期細胞無明顯影響(P>0.05)，而塞來昔布可使G2期細胞所占百分比降低；與二甲雙胍或塞來昔布單藥相比，兩藥聯(lián)用可增加G0/G1期細胞百分比，減少S期細胞百分比(P<0.05)。與對照組相比，二甲雙胍和塞來昔布均可使SGC-7901細胞的存活率降低(P<0.05)，兩藥聯(lián)合能夠顯著增強二甲雙胍或塞來昔布單藥對SGC-7901細胞增殖的抑制作用(P<0.05)(見表3)。

表3 二甲雙胍和塞來昔布單用或聯(lián)合對SGC-7901細胞增殖的影響

注：與對照組相比，aP<0.05；與二甲雙胍組相比，bP<0.05；與塞來昔布組相比，cP<0.05。

2.3二甲雙胍和塞來昔布單用或聯(lián)合對SGC-7901細胞凋亡的影響10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來昔布作用48 h后，SGC-7901細胞的凋亡率較對照組均明顯升高(P<0.05)，而兩藥聯(lián)用后，SGC-7901細胞的凋亡率明顯高于二甲雙胍和塞來昔布的單藥作用(P<0.05，見圖1和表4)。

2.4二甲雙胍和塞來昔布單用或聯(lián)合對SGC-7901細胞中相關(guān)蛋白表達的影響10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來昔布處理SGC-7901細胞后，均能夠使細胞中PCNA、Cyclin D1和Bcl-2表達降低，而Bax表達升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥后，細胞中PCNA、Cyclin D1、Bax和Bcl-2的表達變化明顯大于二甲雙胍和塞來昔布的單藥作用(P<0.05，見圖2、表5)。

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率Fig 1 The apoptosis rate of cells detected by flow cytometry in each group

組別凋亡率對照組2.37±0.12二甲雙胍組18.56±1.05a塞來昔布組22.13±2.26a聯(lián)合組29.64±2.18bcF值144.680P值0.000

注：與對照組相比，aP<0.05；與二甲雙胍組相比，bP<0.05；與塞來昔布組相比，cP<0.05。

圖2 Western blotting 檢測各組細胞中PCNA、Cyclin D1、Bax和Bcl-2蛋白的表達Fig 2 Expressions of PCNA, Cyclin D1, Bax and Bcl-2 proteins in each group detected by Western blotting

組別PCNACyclin D1BaxBcl-2對照組0.82±0.050.87±0.060.23±0.020.46±0.04二甲雙胍組0.52±0.03a0.63±0.05a0.32±0.03a0.24±0.03a塞來昔布組0.48±0.03a0.41±0.03a0.46±0.03a0.20±0.02a聯(lián)合組0.28±0.02bc0.25±0.03bc0.73±0.05bc0.12±0.01bcF值126.894110.380121.61784.667P值0.0000.0000.0000.000

注：與對照組相比，aP<0.05；與二甲雙胍組相比，bP<0.05；與塞來昔布組相比，cP<0.05。

3 討論

發(fā)病率和死亡率很高的胃癌是威脅我國民眾健康的重大公共衛(wèi)生問題。目前針對失去手術(shù)根治機會的晚期胃癌患者，化療為主的綜合治療仍是其治療的主要方式，盡管患者的生存期有所延長，但后期帶來的不良反應(yīng)也極大，尋找安全有效的治療藥物一直是胃癌領(lǐng)域的研究熱點。二甲雙胍是治療糖尿病的降糖藥物，塞來昔布是一種COX-2選擇性抑制劑，兩者不良反應(yīng)小，且均有較好的抗腫瘤價值。GUO等[10]研究指出，二甲雙胍可通過調(diào)控LKB1/AMPK信號通路抑制非小細胞肺癌細胞增殖、誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，并促進腫瘤細胞凋亡；KATO等[11]通過體內(nèi)和體外試驗證實二甲雙胍通過調(diào)控miRNAs來抑制人胰腺癌細胞增殖和腫瘤生長。WANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可通過抑制NF-κB途徑誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，抑制細胞增殖，誘導細胞周期阻滯在G1期。CHIANG等[13]指出，COX-2在口腔癌中的過度表達增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以塞來昔布處理的移植瘤小鼠可通過阻斷波形蛋白、細胞黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子等抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞遷移。目前，關(guān)于二甲雙胍或者塞來昔布抗胃癌的作用已得到證實，如CHEN等[14]研究指出，二甲雙胍可通過抑制HIF1α/PKM2信號通路降低胃癌細胞的存活、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯；曹宇勃等[15]指出，塞來昔布可通過抑制PI3K/Akt活化，增強雷帕霉素抗胃癌BGC823細胞生長的作用。近年來有報道[9]指出，二甲雙胍和塞來昔布聯(lián)合用藥可起到協(xié)同抗胰腺癌細胞增殖，并激活Caspase-3誘導腫瘤細胞凋亡的作用，那么二甲雙胍和塞來昔布聯(lián)合是否抗胃癌效果更佳？我們以不同濃度的二甲雙胍和塞來昔布處理體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞后發(fā)現(xiàn)，兩者均能夠呈時間-劑量效應(yīng)抑制SGC-7901細胞的增殖。以接近IC50值濃度的二甲雙胍和塞來昔布單獨或聯(lián)合處理72 h后，與二甲雙胍和塞來昔布單獨處理組相比，聯(lián)合用藥組中SGC-7901細胞的存活率明顯降低，細胞在G0/G1期所占百分比增加，S期百分比減少，并且細胞凋亡率明顯升高。提示，二甲雙胍和塞來昔布聯(lián)用可起到協(xié)同抗胃癌的作用。

二甲雙胍和塞來昔布抗腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制尚不完全清楚。董麗儒等[16]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過抑制細胞增殖核抗原PCNA和Ki-67及細胞周期蛋白Cyclin D1的表達抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，增加細胞凋亡。PATEL等[17]報道指出，二甲雙胍通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax表達誘導卵巢癌細胞凋亡，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期和S期。同時，塞來昔布也可以通過調(diào)控PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax的表達發(fā)揮抗腫瘤作用。例如：SETIA等[18]發(fā)現(xiàn)，塞來昔布抗結(jié)腸癌的分子機制與抑制PCNA和Bcl-2表達有關(guān)；LIU等[19]指出，塞來昔布可通過調(diào)控Bcl-2和Cyclin D1表達抑制鼻咽癌HONE1細胞增殖。PCNA僅表達在增殖細胞核中，可反映DNA復(fù)制的活躍程度，Cyclin D1在調(diào)控細胞從G1期進入S期過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，細胞周期調(diào)控異常往往會導致細胞增殖的失控，PCNA和Cyclin D1常常被作為評估細胞增殖活性的重要指標；Bcl-2和Bax是公認抑凋亡基因和促凋亡基因，兩者常被作為評估細胞凋亡的重要指標；PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax的異常表達均與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[20-21]。為了探討二甲雙胍聯(lián)合塞來昔布抑制胃癌細胞增殖和誘導細胞凋亡的分子機制，我們采用Western blotting進一步檢測SGC-7901細胞中PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組細胞中PCNA、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達的下降幅度及Bax蛋白表達的升高幅度明顯高于二甲雙胍和塞來昔布單藥處理組。提示，二甲雙胍聯(lián)合塞來昔布可通過下調(diào)PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和上調(diào)Bax表達發(fā)揮抗胃癌的作用。

綜上所述，二甲雙胍和COX-2選擇性抑制劑塞來昔布可通過下調(diào)PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和上調(diào)Bax表達這一相同的調(diào)控機制抑制胃癌SGC-7901細胞增殖，促進細胞凋亡，兩藥聯(lián)合應(yīng)用可起到協(xié)同抗腫瘤的作用，二甲雙胍和塞來昔布的聯(lián)合用藥有望成為治療胃癌的新策略。