李曉亮，楊志剛，馬希濤，王朝杰

(1.河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450000；2.河南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

肺腺癌是肺癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，由于其早期癥狀不典型，絕大多數(shù)肺腺癌患者確診時(shí)已為局部晚期或晚期[1-2]。肺腺癌的發(fā)病和預(yù)后與生活習(xí)慣、空氣污染、遺傳等因素有關(guān)，目前已從細(xì)胞、動(dòng)物水平對(duì)肺癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行了研究，但無(wú)論是細(xì)胞還是動(dòng)物組織均無(wú)法反映人類(lèi)的真實(shí)情況，若直接從人肺組織的蛋白水平研究肺癌，可以詳細(xì)了解肺腺癌的發(fā)病過(guò)程。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的日益完善，一些肺癌標(biāo)志物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，transgelin-2可能與肺癌發(fā)病相關(guān)[3]。肺癌的分化程度越低，預(yù)后越差，但有關(guān)能夠反映肺癌分化程度的標(biāo)志物的研究較少，因此，希望通過(guò)本研究能發(fā)現(xiàn)與肺癌分化程度有關(guān)的蛋白標(biāo)志物。

雙向凝膠電泳技術(shù)(two dimensional gel electrophoresis，2-DE)建立肺腺癌及癌旁正常組織的凝膠電泳圖譜的重復(fù)性高，分辨率好；基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)主要將凝膠電泳圖譜中的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定。因此，本研究應(yīng)用中分化腺癌及癌旁正常組織為樣本，通過(guò)對(duì)比2-DE建立的雙向凝膠電泳圖譜，篩選出差異蛋白點(diǎn)，應(yīng)用MALDI-TOF-MS對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，尋找與肺腺癌發(fā)生和分化程度相關(guān)的蛋白質(zhì)，以期為肺腺癌的診治提供線(xiàn)索。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2017年1～12月河南省人民醫(yī)院收治的中分化肺腺癌患者為研究對(duì)象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 經(jīng)病理檢查確診為中分化肺腺癌；(2)可耐受手術(shù)。共納入中分化肺腺癌患者20例，男12例，女8例，年齡52～71(61.45±4.27)歲；組織分化程度為中分化；腫瘤分期：Ⅰb期1例，Ⅱa期4例，Ⅱb期7例，Ⅲa 期8例。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑與儀器尿素、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸二鈉、三氯醋酸、胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)。TGL-16c 離心機(jī)(德國(guó)Anke公司)，722可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海上天精密儀器有限公司)，Transference Decoloring Ts-8搖床(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，HY-5水平搖床(金壇市榮華儀器制造有限公司)，IPGphorII等電聚焦儀、第二向電泳儀、Uamax掃描儀(美國(guó)Amersham公司)，Ultraflex MALDI-TOF質(zhì)譜儀(美國(guó)BrukerDaltonics公司)。

1.3組織蛋白濃度測(cè)定收集20例患者的癌組織及癌旁正常組織，使其處于無(wú)菌環(huán)境中，經(jīng)生理鹽水多次沖洗后立即放入-80 ℃液氮中保存?zhèn)溆?。收集的?biāo)本冰浴下剪碎并磨制成粉。每個(gè)樣品精確取100 mg粉末，加入1 mL蛋白裂解液中，混合均勻，在冰浴條件下使用超聲細(xì)胞破碎儀操作3～4次，每次持續(xù)約15 s。將處理后的樣品于4 ℃下放置2 h，然后12 000 r·min-1離心5 min。靜置5 min后，取少量上清液，采用Bradford法測(cè)上清液中蛋白質(zhì)濃度，其余上清液放入液氮中保存。

1.4肺癌組織蛋白雙向凝膠電泳操作步驟嚴(yán)格按照GORG等[4]的方法與IPGphor等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行。取出冷凍的固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)膠條，置于常溫環(huán)境下直至膠條恢復(fù)至常溫。將含組織蛋白的上清液與水化液混合均勻后，將IPG膠條放入混合液水化40 min，取出IPG膠條放置聚焦盤(pán)中行等電聚焦電泳。然后將膠條在平衡液和含碘乙酰胺的平衡液中晃動(dòng)震蕩各15 min后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。在電泳過(guò)程中注意電流大小的變換以樣品濃縮成一條線(xiàn)為標(biāo)志，以溴酚藍(lán)前沿移動(dòng)至凝膠底邊為電泳結(jié)束標(biāo)志。電泳結(jié)束后，將膠條放入考馬斯亮藍(lán) R250染色液中染色2 h(染色液中考馬斯亮藍(lán)R-250占 10%，冰醋酸占10%，無(wú)水乙醇占5%，去離子水占75%，均為體積比)。最后在脫色液中對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)脫色，樣品背景透明為脫色完成后得到雙向電泳圖譜。同一標(biāo)本的總蛋白質(zhì)均重復(fù)檢測(cè)3次。

1.5雙向電泳圖譜分析采用UMAX imagescanner掃描儀分別掃描2種組織的雙向電泳圖譜，獲取分辨率為300DPI的凝膠圖像，然后對(duì)凝膠圖像進(jìn)行處理，建立2-DE平均凝膠圖像，選取差異2倍以上的蛋白點(diǎn)。

1.6差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析將2種組織的雙向電泳圖中的差異蛋白點(diǎn)切下，于37 ℃下在100 μL超純水中浸泡適當(dāng)時(shí)間，然后將差異蛋白點(diǎn)放入100 μL脫色液中進(jìn)行脫色，每個(gè)差異性蛋白點(diǎn)至少脫色3次，以凝膠變?yōu)闊o(wú)色透明為準(zhǔn)。對(duì)凝膠進(jìn)行真空干燥處理，使樣品處在冰浴的狀態(tài)下，向樣品中加入10 μL胰蛋白酶。然后將樣品置于37 ℃下孵育9 h，添加10 μL工作液，持續(xù)孵育9～16 h，以保留液濃縮為5～6 μL為準(zhǔn)。將濃縮后的保留液通過(guò)質(zhì)譜儀進(jìn)行處理，最終獲得差異蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprint，PMF)。

1.7差異蛋白的鑒定將獲得的差異蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜使用Mascpt軟件在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢(xún)，鑒定出差異蛋白。

2 結(jié)果

2.1人肺腺癌組織及癌旁正常組織2-DE圖譜及差異蛋白分析肺腺癌組織和癌旁正常組織的平均蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1 810±167、1 703±53。肺腺癌組織和癌旁正常組織中篩選出18個(gè)差異2倍以上的蛋白點(diǎn)，其中10個(gè)差異蛋白點(diǎn)在肺腺癌組織中表達(dá)上升。

A：肺腺癌組織雙向凝膠電泳圖譜；B：癌旁正常組織雙向凝膠電泳圖譜；箭頭所示為差異蛋白點(diǎn)。

圖1肺腺癌組織及癌旁正常組織中差異蛋白2-DE圖譜

Fig.12-DEimageofdifferentialproteinsinlungadenocarcinomatissueandadjacentnormaltissues

2.2人肺腺癌組織和癌旁正常組織中差異蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜分析及鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。18個(gè)差異蛋白點(diǎn)中13個(gè)蛋白點(diǎn)鑒定成功。該13個(gè)差異蛋白中有10個(gè)在肺腺癌組織高表達(dá)，包括腫瘤翻譯調(diào)控蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶1、14-3-3σ蛋白、乙醇脫氫酶、醛脫氫酶1、α-烯醇化酶、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)8等，其中腫瘤翻譯調(diào)控蛋白與14-3-3 σ蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜見(jiàn)圖2、圖3。

表1肺腺癌組織及癌旁正常組織中差異蛋白點(diǎn)鑒定結(jié)果

Tab.1Identificationresultsofdifferentialproteinsinlungadenocarcinomatissueandadjacentnormaltissues

蛋白點(diǎn)號(hào)蛋白名稱(chēng)等電點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量覆蓋率Mascot得分表達(dá)水平215腫瘤翻譯調(diào)控蛋白4.8419 69729%89↑222組織蛋白酶前體B5.8838 75228%74↑298磷酸丙糖異構(gòu)酶16.4526 91054%209↑35414-3-3σ蛋白4.6827 87137%84↑359碳酸酐酶16.5928 90944%110↓363碳酸酐酶16.5928 90937%79↓574乙醇脫氫酶6.3236 89256%210↑804醛脫氫酶16.355 42727%117↑807醛脫氫酶16.355 42735%153↑2 038α-烯醇化酶7.0147 48130%95↑2 040α-烯醇化酶7.0147 48136%114↑2 042CK85.5253 52928%120↑2 043β球蛋白7.8616 10176%149↓

圖2腫瘤翻譯調(diào)控蛋白的PMF

Fig.2PMFoftranslationally-controlledtumorprotein

圖314-3-3σ的PMF

Fig.3PMFof14-3-3σprotein

3 討論

蛋白質(zhì)作為基因的最終產(chǎn)物，直接參與各種功能的執(zhí)行。腫瘤發(fā)生的不同階段蛋白質(zhì)表達(dá)不同，而蛋白質(zhì)組學(xué)可以篩檢不同組織或疾病不同發(fā)展階段的蛋白表達(dá)差異，因此，有可能為腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、治療靶點(diǎn)提供較為可靠的依據(jù)。

2-DE是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要手段之一?？稍谙嗤瑮l件下根據(jù)不同蛋白的等電點(diǎn)和分子量的不同，分離數(shù)千種蛋白，適合分離腫瘤和正常組織的蛋白，進(jìn)而準(zhǔn)確分析腫瘤相關(guān)蛋白。本研究通過(guò)雙向凝膠電泳技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定出13個(gè)差異蛋白，包括各種參與生命過(guò)程的酶及前體、細(xì)胞本身的結(jié)構(gòu)蛋白、腫瘤抑制因子及相關(guān)蛋白，如α-烯醇化酶、細(xì)胞角蛋白、腫瘤翻譯調(diào)控蛋白等。

α-烯醇化酶作為一種多功能蛋白，除了在糖酵解的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在腫瘤的形成和發(fā)展過(guò)程中也起到了極其重要的作用。由于不同部位的α-烯醇化酶生物學(xué)功能不同，因此，分布在細(xì)胞不同部位的α-烯醇化酶對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到的作用也不相同。位于細(xì)胞膜的α-烯醇化酶，其C端包含由16個(gè)氨基酸構(gòu)成的可以錨定細(xì)胞膜的跨膜結(jié)構(gòu)域。在腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中纖溶酶原系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用，而細(xì)胞中α-烯醇化酶與纖維蛋白溶酶原結(jié)合可促進(jìn)其活化，活化的纖維蛋白溶酶原可激活纖溶酶原系統(tǒng)，進(jìn)而通過(guò)參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜重塑為腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移提供間接幫助[5-6]。α-烯醇化酶還可以促進(jìn)癌細(xì)胞的糖酵解過(guò)程，從而加速癌細(xì)胞的能量代謝，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供充足的能量。有研究發(fā)現(xiàn)，位于細(xì)胞質(zhì)中的α-烯醇化酶可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[7]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，α-烯醇化酶在非小細(xì)胞肺癌中通過(guò)加快細(xì)胞生長(zhǎng)周期、促進(jìn)糖酵解及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中α-烯醇化酶的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。因此，α-烯醇化酶極有可能是通過(guò)加強(qiáng)糖酵解、激活纖溶酶原系統(tǒng)等途徑促進(jìn)肺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等。

CK是人體細(xì)胞重要的骨架蛋白之一，在人體內(nèi)主要位于上皮細(xì)胞。根據(jù)分子量的不同和等電點(diǎn)的差異，主要分為酸性CK(CK9～CK19)和中性CK(CK1～CK8)。但在間葉組織中CK基本不存在，因此，可根據(jù)CK來(lái)判斷惡性腫瘤的來(lái)源，并以此對(duì)腫瘤進(jìn)行分類(lèi)，這對(duì)了解細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、癌癥發(fā)生的過(guò)程具有重要意義[9-10]。CK8主要在非鱗狀上皮細(xì)胞中表達(dá)，如移行上皮細(xì)胞、氣管上皮、小腸、胃及結(jié)腸等，在單層和假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞中則主要表達(dá)CK18。以往的研究表明，通過(guò)CK8/18對(duì)肺腺癌進(jìn)行前期的診斷，其準(zhǔn)確度可達(dá)71.7%，敏感度可達(dá)100.0%，特異度為16.7%[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，血清CK8 水平的增加與非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展顯著相關(guān)[12]。因此，CK8在癌癥領(lǐng)域的多個(gè)方面均發(fā)揮著重要的作用。

腫瘤翻譯調(diào)控蛋白是參與細(xì)胞增殖、分化與凋亡的主要因子，還參與細(xì)胞骨架重排等，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有著重要關(guān)系。p53是重要的腫瘤抑制因子和促凋亡基因。腫瘤翻譯調(diào)控蛋白在重組人果糖-1，6-二磷酸酶的控制下，可進(jìn)一步加強(qiáng)p53的泛素化降解，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞凋亡[13]。還有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤翻譯調(diào)控蛋白可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的耐藥性，提示其可能是應(yīng)對(duì)腫瘤耐藥的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[14]。LIU 等[15]探討了雙氫青蒿素對(duì)A549肺癌細(xì)胞中腫瘤翻譯調(diào)控蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，減少腫瘤翻譯調(diào)控蛋白在A(yíng)549細(xì)胞中的表達(dá)，可有效抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。因此，腫瘤翻譯調(diào)控蛋白有可能是非小細(xì)胞肺癌的潛在治療靶點(diǎn)。

以上這些蛋白有可能與肺腺癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，并且有可能成為診斷肺癌的標(biāo)志物，但本研究樣本量有限，如果擴(kuò)大樣本量，并將蛋白質(zhì)組學(xué)與臨床結(jié)合起來(lái)，將有助于肺腺癌的診斷和治療。