李思海，楊 軍，魏 婭

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450000)

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是一種常見的慢性綜合征，臨床表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、感覺異?；驒C(jī)械性疼痛等，若不進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)則可能進(jìn)展為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。NPP的發(fā)生涉及外周感受器、中樞感受器等多個(gè)級(jí)聯(lián)環(huán)節(jié)及多種細(xì)胞受體、細(xì)胞因子、信號(hào)通路的參與[2]。炎癥反應(yīng)可由多種因素激活，在NPP發(fā)生中具有重要作用[3]。ALLISON等[4]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元的細(xì)胞炎性因子水平升高可能是導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛的原因，采用靶向炎癥藥物治療可緩解神經(jīng)性疼痛。炎性介質(zhì)可通過一系列信號(hào)傳遞活化神經(jīng)元內(nèi)的蛋白激酶，調(diào)控細(xì)胞膜離子通道活性，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加，進(jìn)一步影響離子型N-甲基-D-門冬氨酸受體的功能，誘導(dǎo)脊髓背角區(qū)域敏感化，造成神經(jīng)疼痛[5]。地佐辛是一種阿片受體激動(dòng)-拮抗劑，靜脈注射后可完全激活κ受體，對(duì)μ受體部分激活、部分抑制，實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用，且很少產(chǎn)生嘔吐、惡心等不良反應(yīng)。臨床應(yīng)用表明，地佐辛可明顯改善癌癥患者和術(shù)后患者的疼痛感，且持續(xù)時(shí)間較長[6]，但地佐辛對(duì)NPP的作用尚不清楚。本研究通過觀察地佐辛對(duì)NPP模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)炎性信號(hào)通路的影響，探討其減輕NPP大鼠疼痛的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組無特定病原體級(jí)Sprauge Dawley大鼠90只，體質(zhì)量200～220 g，購自上海邦耀生物有限公司，許可證號(hào)：SYXK(滬)-2014-0001。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組，每組15只。各組大鼠均于(22.00±2.50) ℃、相對(duì)濕度50%～70%的干凈、通風(fēng)環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，自由活動(dòng)。本研究涉及實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器地佐辛(揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20080329，1 mL5 mg)，普瑞巴林膠囊(重慶賽維藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20130073)，氯化鈉注射液(輔仁藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32023395)，青霉素鉀注射液(河南新鄉(xiāng)華星藥廠，國藥準(zhǔn)字H41020816)，戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31021724)，兔TLR4抗體、兔NF-κB抗體、兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、酶標(biāo)志羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(美國Abcam公司)，蛋白提取試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic，BCA)試劑盒及白細(xì)胞介素-6(intedeukin-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。1658001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，2500凝膠成像和分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，TGL-16B低溫高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)，ND2000自動(dòng)分光光度計(jì)(美國Thermo公司)，觸覺測量套件(美國Stoelting公司)，390型熱刺激器(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)。

1.3動(dòng)物模型制備模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠參照GRACE等[7]的方法制備NPP模型，術(shù)前禁食、不禁水12 h，給予戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，俯臥位捆綁固定，脊椎背部皮膚消毒后，縱向切開第4～6腰椎部位背部中線皮膚，小心逐層分離脊椎左側(cè)肌肉，暴露出第5腰神經(jīng)，采用無菌3.0絲線結(jié)扎左側(cè)第5腰神經(jīng)，之后迅速逐層縫合背部切口，消毒后放回動(dòng)物房。假手術(shù)組大鼠僅暴露第5腰神經(jīng)，不予結(jié)扎，然后逐層縫合背部切口。術(shù)后各組大鼠均每日肌肉注射 4×104U青霉素，連續(xù)3 d。術(shù)后1 d，模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠均出現(xiàn)抬足次數(shù)增多、跛行、舔足等行為，提示NPP模型大鼠制備成功。若各實(shí)驗(yàn)組大鼠數(shù)量不足15只，則通過隨機(jī)原則取備用大鼠補(bǔ)足。術(shù)后第4天，地佐辛低、中、高劑量組大鼠分別給予6、12、24 mg·kg-1地佐辛腹腔注射；普瑞巴林組大鼠給予18 mg·kg-1普瑞巴林腹腔注射；假手術(shù)組和模型組大鼠給予氯化鈉注射液腹腔注射，各組注射量均為1 mL·kg-1，連續(xù) 7 d，每天1次。

1.4大鼠行為學(xué)測定

1.4.1機(jī)械痛閾值(mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)檢測術(shù)前及術(shù)后第4、11天測試前，大鼠于20 cm×25 cm×15 cm塑料盒中適應(yīng) 30 min，采用Von-Frey細(xì)絲刺激大鼠左后足趾面，依次增強(qiáng)刺激力度，每次刺激持續(xù)4～6 s，以細(xì)絲現(xiàn)肉眼可見稍微彎曲為完全受力標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)大鼠出現(xiàn)快速縮足時(shí)為陽性反應(yīng)，記錄此時(shí)刺激力度，即為MWT。每只大鼠測試5次，取平均值。

1.4.2熱縮足反射潛伏期(thermalwithdrawallatency，TWL)檢測術(shù)前及術(shù)后第4、11天測試前，大鼠于透明塑料盒中適應(yīng)30 min，采用熱刺激器產(chǎn)生的熱束刺激大鼠左后足趾面，當(dāng)大鼠出現(xiàn)特征性舔爪或提爪時(shí)為陽性反應(yīng)，記錄大鼠響應(yīng)熱刺激的潛伏時(shí)間，即為TWL。每只大鼠測試5次，取均值。為避免傷害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究中測試時(shí)間為 30 s，觸發(fā)溫度為30 ℃。

1.5大鼠脊髓組織標(biāo)本制備術(shù)后第11天處死各組大鼠，采集大鼠左側(cè)脊髓，制備勻漿液，分為2份，1份于4 ℃下3 000 r·min-1離心5 min，取上清液置于-80 ℃保存，用于檢測IL-6、MCP-1、TNF-α 水平；另1份置于-80 ℃保存，用于檢測TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況。

1.6各組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1和TNF-α水平檢測取-80 ℃保存的各組大鼠脊髓組織上清液，使用自動(dòng)分光光度計(jì)采用ELISA試劑盒檢測脊髓組織上清液中IL-6、MCP-1和TNF-α水平。

1.7各組大鼠脊髓組織中TLR4和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測取各組大鼠冷凍脊髓組織勻漿液適量，加入適量蛋白裂解液，部分用蛋白提取試劑盒提取脊髓組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白量，首先利用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用自動(dòng)分光光度計(jì)測定待測蛋白吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測蛋白濃度。取30 mg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后以50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h；分別加入兔源TLR4、NF-κB、GAPDH(1500)抗體，4 ℃ 孵育過夜；洗凈一抗后加入二抗(15 000)，室溫孵育1 h。經(jīng)Western blot化學(xué)發(fā)光液作用后拍攝圖像，以TLR4、NF-κB蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.16組大鼠MWT比較結(jié)果見表1。各組大鼠術(shù)前MWT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.261，P>0.05)。術(shù)后第4、11天，模型組、普巴瑞林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠MWT顯著低于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠的MWT顯著低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第4天，模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠MWT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第11天，模型組大鼠MWT顯著低于術(shù)后第4天，普巴瑞林組及地佐辛中、高劑量組大鼠MWT顯著高于術(shù)后第4天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第11天，普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠MWT顯著高于模型組，普瑞巴林組及地佐辛中、高劑量組大鼠MWT顯著高于地佐辛低劑量組，普瑞巴林組及地佐辛高劑量組大鼠MWT顯著高于地佐辛中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地佐辛高劑量組與普瑞巴林組大鼠MWT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表16組大鼠手術(shù)前、后MWT比較

組別n術(shù)前術(shù)后第4天術(shù)后第11天假手術(shù)組 1513.57±2.0613.79±2.49 13.62±2.45 模型組 1513.82±2.545.67±1.11ab3.75±0.71abc普瑞巴林組 1513.26±2.235.58±1.12ab11.86±1.97abcdef地佐辛低劑量組 1514.17±2.685.61±1.17ab5.94±1.12abd地佐辛中劑量組 1513.71±2.145.82±1.15ab8.74±1.69abcde地佐辛高劑量組 1513.93±2.435.73±1.14ab11.14±2.01abcdef

注：與術(shù)前比較aP<0.05；與假手術(shù)組比較bP<0.05；與術(shù)后第4天比較cP<0.05；與模型組比較dP<0.05；與地佐辛低劑量組比較eP<0.05；與地佐辛中劑量組比較fP<0.05。

2.26組大鼠TWL比較結(jié)果見表2。各組大鼠術(shù)前TWL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.662，P>0.05)。術(shù)后第4天，模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠TWL比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第4、11天，模型組、普巴瑞林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠TWL均顯著低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠的TWL顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后第11天，普巴瑞林組及地佐辛中、高劑量組大鼠TWL均顯著高于術(shù)后第4天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第11天，普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠TWL顯著高于模型組，普瑞巴林組及地佐辛中、高劑量組大鼠TWL顯著高于地佐辛低劑量組，普瑞巴林組及地佐辛高劑量組大鼠TWL顯著高于地佐辛中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，地佐辛高劑量組與普瑞巴林組大鼠TWL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表26組大鼠手術(shù)前、后TWL比較

組別n術(shù)前術(shù)后第4天 術(shù)后第11天假手術(shù)組 1512.25±2.1312.67±2.37 12.79±2.25 模型組 1512.34±2.345.89±1.15ab5.78±1.12ab普瑞巴林組 1511.67±2.095.91±1.16ab10.98±1.94abcdef地佐辛低劑量組 1513.12±2.346.78±1.34ab6.98±1.43abd地佐辛中劑量組 1512.68±2.496.23±1.23ab9.76±1.68abcde地佐辛高劑量組 1512.51±2.376.41±1.28ab11.03±2.05abcdef

注：與術(shù)前比較aP<0.05；與假手術(shù)組比較bP<0.05；與術(shù)后第4天比較cP<0.05；與模型組比較dP<0.05；與地佐辛低劑量組比較eP<0.05；與地佐辛中劑量組比較fP<0.05。

2.36組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1及TNF-α水平比較結(jié)果見表3。術(shù)后第11天，模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1和TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1和TNF-α水平顯著低于模型組，普瑞巴林組及地佐辛中、高劑量組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1和TNF-α水平顯著低于地佐辛低劑量組，普瑞巴林組及地佐辛高劑量組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1和TNF-α水平顯著低于地佐辛中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地佐辛高劑量組與普瑞巴林組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1和TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表36組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1及TNF-α水平比較

組別nIL-6/(ng·L-1)MCP-1/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)假手術(shù)組 15153.31±22.21 12.46±3.32 241.23±25.94 模型組 15465.68±51.13a65.98±11.07a684.51±53.69a普瑞巴林組 15201.52±36.79abcd20.12±3.58abcd260.07±37.98abcd地佐辛低劑量組 15397.75±42.26ab52.27±9.43ab598.27±47.45ab地佐辛中劑量組 15252.51±35.46abc38.99±7.78abc421.43±52.83abc地佐辛高劑量組 15197.64±23.89abcd19.92±3.23abcd253.92±32.87abcd

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與地佐辛低劑量組比較cP<0.05；與地佐辛中劑量組比較dP<0.05。

2.46組大鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見表4、圖1。術(shù)后第11天，模型組、普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠脊髓組織中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；普瑞巴林組及地佐辛低、中、高劑量組大鼠脊髓組織中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組，普瑞巴林組及地佐辛中、高劑量組大鼠脊髓組織中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于地佐辛低劑量組，普瑞巴林組及地佐辛高劑量組大鼠脊髓組織中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于地佐辛中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地佐辛高劑量組與普瑞巴林組大鼠脊髓組織中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表46組大鼠脊髓組織中TLR4及NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

組別nTLR4蛋白NF-κB蛋白假手術(shù)組 150.51±0.110.47±0.14模型組 152.38±0.55a2.26±0.42a普瑞巴林組 150.55±0.09abcd0.48±0.08abcd地佐辛低劑量組 151.91±0.34ab1.89±0.23ab地佐辛中劑量組 151.15±0.12abc1.02±0.04abc地佐辛高劑量組 150.49±0.11abcd0.51±0.05abcd

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與地佐辛低劑量組比較cP<0.05；與地佐辛中劑量組比較dP<0.05。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：普瑞巴林組；D：地佐辛低劑量組；E：地佐辛中劑量組；F：地佐辛高劑量組。

圖16組大鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

Fig.1ExpressionofTLR4，NF-κBproteininspinalcordtissuesofratsinthesixgroups

3 討論

NPP是由于軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病導(dǎo)致的功能障礙所引起的痛覺過敏、感覺異常等疼痛性感受[8-9]，及時(shí)有效地對(duì)早、中期患者進(jìn)行干預(yù)和治療，有利于控制神經(jīng)系統(tǒng)損傷進(jìn)程、改善神經(jīng)系統(tǒng)功能[10]。機(jī)體脊髓及外周傷害性感受神經(jīng)元的異常敏感化是NPP病變的首要步驟，傷害性感受神經(jīng)元的去敏感化可抑制神經(jīng)系統(tǒng)異常激活，減退中樞下行傳遞系統(tǒng)功能，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果[11]。目前，臨床上采用的治療藥物多作用于單一靶點(diǎn)，治療效果欠佳且不良反應(yīng)多[12]。因此，尋找治療效果好且不良反應(yīng)少的藥物是亟需解決的問題。

普瑞巴林是一種神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸類似物，臨床上已應(yīng)用于治療神經(jīng)性疼痛[13]，具有起效快、吸收不受食物影響等優(yōu)點(diǎn)，但可造成過度鎮(zhèn)靜、心臟毒性等不良反應(yīng)。地佐辛是一種阿片類鎮(zhèn)靜劑，主要對(duì)κ受體具有特異激活作用，激活后的κ受體可產(chǎn)生脊髓水平的鎮(zhèn)痛作用，具有鎮(zhèn)痛效果好、依賴性低等優(yōu)點(diǎn)[14]。因此，本研究以普瑞巴林作為標(biāo)準(zhǔn)參照藥物，探究地佐辛對(duì)大鼠神經(jīng)性疼痛的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地佐辛治療后大鼠MWT顯著升高，TWL顯著延長，呈劑量依賴效應(yīng)，且高劑量地佐辛作用效果與普瑞巴林一致，提示地佐辛對(duì)NPP大鼠具有鎮(zhèn)痛作用，以高劑量效果最優(yōu)，但其機(jī)制尚不清楚。WANG等[15]研究表明，地佐辛可通過抑制去甲腎上腺素的再攝取發(fā)揮抗疼痛作用，然而，其鎮(zhèn)痛作用是否與脊髓炎癥反應(yīng)有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

李秋月等[16]研究指出，TNF-α等促炎性因子與NPP密切相關(guān)。Toll樣受體可參與識(shí)別多種病原物，表達(dá)于白細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等表面[17]。一些Toll樣受體如TLR4與炎癥信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[18]。有研究表明，NPP患者的神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)被激活后可導(dǎo)致一系列病變，進(jìn)而引起NPP[19]。因此，炎癥反應(yīng)在NPP中的作用被逐漸重視。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1及TNF-α水平顯著高于假手術(shù)大鼠，提示NPP模型大鼠脊髓組織存在一定炎癥反應(yīng)。GOURD等[20]研究表明，普瑞巴林可減輕放射治療相關(guān)的NPP。本研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量地佐辛治療后，大鼠脊髓組織中IL-6、MCP-1及TNF-α水平均顯著降低，且高劑量地佐辛干預(yù)效果與普瑞巴林一致，提示地佐辛可減輕NPP大鼠脊髓組織炎癥反應(yīng)，其中以高劑量效果最優(yōu)。細(xì)胞表面TLR4表達(dá)增加后，可激活TNF-α等下游炎性因子表達(dá)，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)NF-κB蛋白表達(dá)，進(jìn)一步激活MCP-1、IL-6等促炎性因子表達(dá)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，提示NPP大鼠脊髓組織中TLR4/NF-κB炎性信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。經(jīng)低、中、高劑量地佐辛治療后，大鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著低于模型組，且高劑量地佐辛干預(yù)后最低，推測地佐辛可能通過抑制TLR4/NF-κB炎性信號(hào)通路，減輕大鼠NPP。

綜上所述，地佐辛可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活而減輕脊髓炎癥反應(yīng)，從而提高NPP大鼠MWT，延長TWL，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。然而，本研究僅涉及地佐辛對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)炎性因子在大鼠脊髓組織中表達(dá)的影響，有待對(duì)該通路進(jìn)行深入研究。