陳惠軍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院兒科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

近年來，對Janus激酶/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)通路的研究主要集中在肝臟、心臟、腎臟及淋巴系統(tǒng)疾病和腫瘤等，而對其在腦缺血損傷中作用的研究較少[1]。研究顯示，JAK/STAT通路在調(diào)節(jié)腦缺血后細胞因子的反應(yīng)中具有重要作用，STAT3可以激活miR-21的表達，進而影響細胞存活與發(fā)展[2]。新生兒缺氧缺血性腦病 (hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是各種原因引起腦組織缺血缺氧，造成神經(jīng)細胞凋亡與壞死，導(dǎo)致神經(jīng)功能低下而成為永久性的損害[3-4]。有關(guān)JAK/STAT通路在缺血性腦損傷中的作用尚存在爭議，有學(xué)者認為其可以發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用[5]，也有學(xué)者認為其可導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡[6]。因此，探討JAK/STAT通路在HIE發(fā)病機制中的作用對進一步防治HIE具有重要意義。本研究在建立新生大鼠HIE模型的基礎(chǔ)上，觀察阻斷JAK/STAT3通路對新生大鼠HIE發(fā)生、發(fā)展的影響，為HIE的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物7日齡清潔級新生Wistar大鼠70只，體質(zhì)量11～18 g，雌雄不限，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2007-0001。

1.2主要試劑與儀器STAT3、微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)(美國Abcam公司)，JAK/STAT3信號通路阻斷劑AG490(美國Sigma公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國Bio-Rad公司)，Eppendorf移液器(德國Eppendorf公司)，DYY-III型電泳槽(北京六一儀器廠)，SW-CJ-ZFD超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，325型旋轉(zhuǎn)切片機(英國Shandon 公司)，Nikon-E400光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3實驗分組與處理將70只新生大鼠隨機分為對照組(10只)、HIE組(30只)和干預(yù)組(30只)。HIE組和干預(yù)組新生大鼠根據(jù)文獻[7]中的方法制備HIE模型：乙醚麻醉新生大鼠，頸部正中切開皮膚，暴露并結(jié)扎左頸總動脈2 h，而后恢復(fù)2 h；然后置于37 ℃恒溫水浴缺氧艙中，輸入混合氣體(含體積分數(shù)8%的氧氣和92%的氮氣)，2 h后取出新生大鼠，由母鼠喂養(yǎng)。干預(yù)組新生大鼠于造模型前 10 min 腹腔注射JAK/STAT信號通路阻斷劑AG490 3 mg·kg-1。對照組新生大鼠僅行左頸總動脈分離，不做結(jié)扎和缺氧處理。

1.4組織標本采集HIE組和干預(yù)組新生大鼠分別于造模后6、48、72 h處死，每組每個時間點處死10只；對照組新生大鼠于48 h時全部處死。大鼠行乙醚麻醉后開胸，經(jīng)心先后灌注磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和40 g·L-1多聚甲醛，斷頭，取大腦海馬(CA1區(qū))組織。標本分為2份，一份置于液氮中保存，待行PCR檢測；另一份用于組織病理學(xué)觀察。

1.5新生大鼠海馬組織病理學(xué)觀察取海馬組織，置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h；常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明；石蠟包埋，切片(片厚約4 μm)，脫蠟至水；行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察大鼠海馬組織病理學(xué)改變。

1.6實時熒光定量PCR檢測大鼠海馬組織中miR-21和STAT3mRNA的表達取適量腦組織，利用TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：RNA 5 μL、N6 Rnadom Primer 0.8 μL、上游和下游引物(10 mmol·L-1)各1 μL，三磷酸脫氧核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)0.4 μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.3 μL、RNasin 0.4 μL、5×緩沖液4 μL，補充焦碳酸二乙酯水至20 μL?；靹蚍磻?yīng)液，放入37 ℃水浴中1 h。94 ℃ 3 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。PCR擴增產(chǎn)物，反應(yīng)體系：cDNA模板5 μL、dNTP(10 mmol·L-1)0.2 μL、上游和下游引物(10 mmol·L-1)各1 μL、10×PCR緩沖液2.5 μL、MgCl2(50 mmol·L-1)0.7 μL、50×SYBR Green 0.12 μL、Taq DNA聚合酶(2 500 kU·L-1)0.4 μL，補充雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 2 min，94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)重復(fù)40次。引物序列由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成，以U6作為miR-21內(nèi)參，β-actin作為STAT3內(nèi)參。miR-21引物序列(70 bp)：上游為5′-GAAATGCCTCACAGCTATCGT-3′，下游為5′-CCT-CCACAAAGAGCCACC-3′；U6引物序列(75 bp)：上游為5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下游為5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′；STAT3引物序列(306 bp)：上游為5′-ACAGGTTTCCAGCACGC-3′，下游為5′-CATCGAGAAAGAGTCTACG-3′；β-actin引物序列(197 bp)：上游為5′-CGTGCAGGCATC-CGGCACGC-3′，下游為 5′-TGGCATAAGGTGAAC-AAGTACAG-3′。采用2-ΔΔCt法[8]分析miR-21和STAT3的相對表達量。

2 結(jié)果

2.13組新生大鼠海馬組織病理學(xué)改變結(jié)果見圖1。對照組新生大鼠海馬組織中神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞的大小、形態(tài)均正常，未見細胞變性及水腫現(xiàn)象。造模后48 h，HIE組新生大鼠海馬組織中神經(jīng)元體積增大，中度水腫，著色不均；干預(yù)組新生大鼠海馬組織中神經(jīng)元體積增大，中、重度水腫，著色不均，可見細胞核固縮，并見小膠質(zhì)細胞輕度增生，間質(zhì)水腫。

A：對照組；B：HIE組造模后48 h；C：干預(yù)組造模后48 h。

圖13組新生大鼠海馬組織病理學(xué)改變(HE染色，×400)

Fig.1Histopathologicalchangesinhippocampaltissuesofneonatalratsinthethreegroups(HEstaining，×400)

2.23組新生大鼠海馬組織中miR-21和STAT3mRNA相對表達量比較結(jié)果見圖2、圖3和表1。造模后6、48、72 h，HIE組和干預(yù)組大鼠海馬組織中miR-21、STAT3 mRNA相對表達量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組大鼠海馬組織中miR-21、STAT3 mRNA相對表達量顯著低于HIE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HIE組和干預(yù)組大鼠造模后48 h海馬組織中miR-21、STAT3 mRNA相對表達量顯著高于造模后6、72 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HIE組和干預(yù)組大鼠造模后6 h與造模后72 h海馬組織中miR-21、STAT3 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

M：Marker；1、2、3：HIE組造模后72、48、6 h；4、12：對照組；5、6、7、8：U6；9、10、11：干預(yù)組造模后72、48、6 h。

圖23組新生大鼠海馬組織中miR-21的表達

Fig.2ExpressionofmiR-21inhippocampaltissuesofneonatalratsinthethreegroups

M：Marker；1、5：對照組；2、3、4：HIE組造模后6、48、72 h；6、7、8：干預(yù)組造模后6、48、72 h。

圖33組新生大鼠海馬組織中STAT3mRNA的表達

Fig.3ExpressionofSTAT3mRNAinhippocampaltissuesofneonatalratsinthethreegroups

表13組新生大鼠海馬組織中miR-21及STAT3mRNA表達比較

組別nmiR-21STAT3 mRNA對照組101.01±0.221.52±0.31HIE組 造模后6 h103.87±5.42a3.67±5.13a 造模后48 h106.33±2.15ac5.01±3.26ac 造模后72 h103.16±3.41a3.21±0.12a干預(yù)組 造模后6 h102.12±2.43ab2.08±4.12ab 造模后48 h103.28±4.65abc3.01±3.26abc 造模后72 h102.18±4.46ab1.87±0.12ab

注：與對照組比較aP<0.05；與HIE組比較bP<0.05；與造模后6、72 h比較cP<0.05。

3 討論

缺氧缺血性腦損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，是造成神經(jīng)細胞損傷壞死的重要原因[9-10]。研究表明，JAK/STAT信號通路與缺氧缺血性腦損傷密切相關(guān)，并影響其發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。STAT3是JAK/STAT信號通路中的關(guān)鍵性基因，在HIE、腫瘤、腦損傷等疾病的發(fā)生、發(fā)展中起主導(dǎo)作用[11]。miR-21是重要的癌基因，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中呈現(xiàn)高表達[12-13]。有研究顯示，HIE新生兒血清miR-21水平升高[4]。采用生物信息學(xué)方法對 miR-21和STAT3靶向配對，進行相關(guān)性的預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者配對關(guān)系密切，STAT3可以直接激活miR-21[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，對照組新生大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)正常，HIE組和干預(yù)組大鼠海馬組織出現(xiàn)顯著病理學(xué)改變，而干預(yù)組大鼠海馬組織病理學(xué)改變較HIE組更嚴重；HIE組大鼠海馬組織中STAT3 mRNA相對表達量顯著高于對照組，而干預(yù)組大鼠海馬組織中STAT3 mRNA相對表達量顯著低于HIE組。缺氧缺血后大鼠海馬組織中JAK/STAT3信號通路被激活，STAT3被激活后誘導(dǎo)細胞周期調(diào)控基因與抗凋亡基因的表達；miR-21調(diào)控細胞增殖，減少細胞凋亡；因此，STAT3和miR-21表達升高可能對腦神經(jīng)細胞起到一定的保護作用；阻斷JAK/STAT3信號通路后STAT3表達降低，失去對miR-21的有效調(diào)控，miR-21也隨之降低，此時，受到miR-21抑制的靶基因如PDCD4、PTEN、TIMP3等表達上調(diào)，腦神經(jīng)細胞受到PDCD4等基因的調(diào)控，出現(xiàn)變性壞死；因此，阻斷JAK/STAT 信號通路可能會對腦組織造成進一步損害[16]。本研究結(jié)果與LIN等[5]實驗結(jié)果基本一致。

綜上所述，腦組織缺氧缺血時STAT3和miR-21表達上調(diào)，其可能對神經(jīng)細胞起到應(yīng)激性保護作用，這一作用可以被JAK/STAT3信號通路阻斷劑AG490阻斷。激活JAK/STAT3信號通路有望成為臨床治療HIE的新靶點。