任恩惠,張廣智,賀學(xué)崗,高一誠,楊風(fēng)光,楊 亮,馬占軍,解琪琪,汪 靜,康學(xué)文*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科,中國甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,中國甘肅蘭州730000)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)常繼發(fā)于交通事故、墜落傷、運(yùn)動(dòng)損傷等原因?qū)е碌淖刁w骨折[1～2],并且通常會(huì)造成癱瘓等嚴(yán)重的后果。脊髓損傷后損傷部位難以修復(fù),患者生活質(zhì)量低,是目前臨床上難以解決的醫(yī)學(xué)難題。脊髓損傷可分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。原發(fā)性脊髓損傷常造成神經(jīng)不可逆損傷,并且由于損傷部位往往伴隨脊髓水腫、脊髓組織缺血、過氧化自由基生成增多以及炎癥反應(yīng)等癥狀,因此可引起繼發(fā)性脊髓損傷[3～6]。由此可知,對于脊髓損傷發(fā)展過程中分子機(jī)制的探究,可以預(yù)測繼發(fā)性脊髓損傷潛在的治療靶點(diǎn)。然而,目前關(guān)于脊髓損傷發(fā)展過程中分子機(jī)制的研究仍然不清楚。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展,研究者可通過高通量基因芯片技術(shù)探究疾病發(fā)生發(fā)展過程中分子的變化,這為脊髓損傷發(fā)展機(jī)制的研究提供了新的方法。

本文通過生物信息學(xué)分析,對脊髓損傷中具有表達(dá)差異的基因進(jìn)行功能富集,分析得到了參與脊髓損傷發(fā)展過程的重要分子和通路,為脊髓損傷發(fā)展機(jī)制的研究提供了新的思路,同時(shí)也為脊髓損傷后修復(fù)的研究提供了新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)信息

本文分析的基因芯片數(shù)據(jù)均來自于GEO數(shù)據(jù)庫,分析的數(shù)據(jù)集為GSE42828、GSE47681和GSE-5296,測序平臺為GPL1261[Mouse430_2]Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array。樣本來源于Mus musculus。提取3個(gè)數(shù)據(jù)集中樣本的基因芯片數(shù)據(jù),并將所有的樣本分為脊髓損傷組(SCI組)和正常組(normal組)。樣本具體分布情況如表1所示。

表1 數(shù)據(jù)集中的樣本分布Table 1 Sample distribution in the dataset

1.2 基因芯片數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化以及差異基因的篩選

合并下載的基因芯片數(shù)據(jù),并通過R語言中的sva包處理來自3個(gè)不同數(shù)據(jù)集樣本之間的批次效應(yīng)。對合并后的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并通過主成分分析(principal component analysis,PCA)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)化后樣本的分布情況。用R語言中的limma包處理標(biāo)準(zhǔn)化后的基因芯片數(shù)據(jù),得到差異基因[7],差異基因篩選條件為:|log2(fold change)|＞0.9,P-value＜0.05。

1.3 功能富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫可從生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個(gè)方面注釋差異基因的功能,是目前進(jìn)行差異基因功能注釋的權(quán)威數(shù)據(jù)庫[8～9]。我們利用DAVID數(shù)據(jù)庫對分析得到的差異基因進(jìn)行GO(gene ontology)分析。同時(shí),利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫[10](https://www.kegg.jp/)對差異基因進(jìn)行通路富集分析,從而得到參與脊髓損傷發(fā)展過程的重要通路。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、hub基因獲取及其功能分析

STRING數(shù)據(jù)庫是一個(gè)可以構(gòu)建蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫[11～12]。我們利用STRING構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),并通過Cytoscape軟件(http://cytoscape.org/download_old_versions.html)進(jìn)行可視化。隨后,利用Cytoscape中的cytoHubba插件經(jīng)MCC算法將蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中得分最高的10個(gè)基因定義為hub基因,并用箱式圖展示了hub基因在SCI組和normal組中的表達(dá)情況。GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)是一個(gè)綜合性數(shù)據(jù)庫,通過該數(shù)據(jù)庫能夠查詢基因的功能。我們通過GeneCards數(shù)據(jù)庫查詢得到hub基因的主要功能。

1.5 GSEA分析

GSEA(gene set enrichment analysis)[13]可對表達(dá)差異不明顯的基因進(jìn)行功能注釋,從而補(bǔ)充差異基因篩選過程中遺漏的關(guān)鍵基因。我們通過R語言clusterProfiler包對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析,進(jìn)一步完善了生物信息學(xué)分析的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控和差異基因的篩選

從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE42828、GSE47681和GSE5296三個(gè)數(shù)據(jù)集中的CEL文件,對不同數(shù)據(jù)集中基因芯片數(shù)據(jù)的批次效應(yīng)進(jìn)行處理,結(jié)果如圖1所示,可見批次效應(yīng)去除成功。進(jìn)一步對處理后的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,結(jié)果如圖2所示,可見標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。PCA結(jié)果表明數(shù)據(jù)合并之后SCI組和normal組中的樣本能夠分開(圖3)。對標(biāo)準(zhǔn)化后的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行貝葉斯檢驗(yàn),總共得到104個(gè)上調(diào)的差異基因。圖4以火山圖的形式展示了所有基因的分布情況,并標(biāo)注了hub基因所處的位置。

2.2 GO分析和KEGG分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫對得到的104個(gè)差異基因進(jìn)行GO分析,結(jié)果如表2所示。差異基因主要參與炎癥反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化性、細(xì)胞對白細(xì)胞介素-1的反應(yīng)、星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移和血管生成等生物過程。就細(xì)胞組分而言,差異基因主要分布在細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞表面、細(xì)胞外外泌體、質(zhì)膜、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位。就分子功能而言,差異基因主要與葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性、趨化因子活性、細(xì)胞因子活性和細(xì)胞因子受體活性等相關(guān)。KEGG分析結(jié)果表明,脊髓損傷后TNF信號通路、NF-κB信號通路、趨化因子信號通路和NOD樣受體信號通路等相關(guān)通路激活(表2),提示以上通路在脊髓損傷發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。

圖1 批次效應(yīng)處理圖Fig.1 Batch effect processing diagram

圖2 原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化圖Fig.2 Raw data normalization map

圖3 主成分分析結(jié)果Fig.3 Principal component analysis results

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和hub基因

將104個(gè)差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫,分析得到其所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系(圖5A)。隨后,通過Cytoscape中的cytoHubba插件分析得到TYROBP、ITGB2、PTPRC、FCER1G、C3AR1、C1QB、CYBB、FCGR2B、PLEK 和 MPEG1等 10個(gè) hub基因(圖5B)。10個(gè)hub基因在SCI組和normal組中的表達(dá)如圖6所示,由圖可知所有hub基因在SCI組的表達(dá)明顯高于normal組。進(jìn)一步通過Gene-Cards數(shù)據(jù)庫查詢得到每一個(gè)hub基因的主要功能,結(jié)果提示炎癥反應(yīng)在脊髓損傷發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用(表3)。

圖4 差異基因表達(dá)情況分布紅色的點(diǎn)代表符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的差異基因的分布,灰色的點(diǎn)代表差異基因以外其他基因的分布。Fig.4 Differential gene expression distributionRed dots represent the distribution of differential genes that meet the screening criteria,and grey dots represent the distribution of genes other than the differential genes.

表2 GO和KEGG分析結(jié)果Table 2 GO and KEGG analyses

2.4 GSEA分析

通過對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析,得到圖7所示的結(jié)果。從圖中可以看出,CCL2、FOS、CDK1、CCND1、IL1B和BAX等基因在脊髓損傷的發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的作用,同時(shí)IL-17信號通路和p53信號通路可能參與了脊髓損傷的發(fā)展機(jī)制。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)和hub基因(A)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)的大小代表度,顏色深淺代表聚類系數(shù),線條的粗細(xì)代表綜合評分；(B)Hub基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。顏色由紅到黃表明基因得分由高到低。Fig.5 PPI network and hub genes(A)Protein interaction network.The size of the circle represents the degree,the depth of the color represents clustering coefficient,and the size of line represents the combined score；(B)Hub gene interaction network.Colors from red to yellow indicate that the gene scores are from high to low.

圖6 Hub基因表達(dá)情況Fig.6 Hub gene expression map

表3 Hub基因的功能Table 3 Functions of the hub genes

4 討論

急性脊髓損傷常常導(dǎo)致患者損傷節(jié)段以下感覺障礙、運(yùn)動(dòng)功能障礙、大小便失衡等[14],嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Liu等[15]總結(jié)了脊髓損傷后的病理機(jī)制:脊髓損傷后機(jī)體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)、活性氧和氧化應(yīng)激能夠引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡等繼發(fā)性損傷,而局部的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生代償性的保護(hù)作用。脊髓損傷后,中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集在損傷部位,并通過分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)、激活蛋白-1(AP-1)和核因子κB(NF-κB)等炎性因子介導(dǎo)繼發(fā)性脊髓損傷[16～20]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷機(jī)制在脊髓損傷發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,在脊髓損傷后的數(shù)小時(shí)內(nèi),過氧化氫(H2O2)、超氧化物和羥基自由基等活性氧在損傷部位聚集,對脊髓中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成氧化損傷,從而對脊髓造成二次損傷[21～22]。相關(guān)研究表明,脊髓損傷不僅會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)損傷的細(xì)胞產(chǎn)生凋亡,而且會(huì)介導(dǎo)損傷部位正常的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[23～24]。目前,雖然已有大量的研究對脊髓損傷分子機(jī)制進(jìn)行了探究,但是相關(guān)工作仍然處于探索階段,很難為臨床治療提供指導(dǎo)。因此,針對脊髓損傷后相關(guān)分子機(jī)制的研究,不僅可加強(qiáng)人們對脊髓損傷發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識,也可為臨床治療提供新的思路?；诖?本文對不同數(shù)據(jù)集中的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了合并,分析得到了104個(gè)高表達(dá)的差異基因。

圖7 GSEA分析結(jié)果Fig.7 GSEA analysis results

功能富集結(jié)果表明,104個(gè)差異基因主要位于細(xì)胞外基質(zhì),主要參與了炎癥反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化性、星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移和血管生成等過程。我們通過對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)展開分析,得到10個(gè) hub 基因:TYROBP、ITGB2、PTPRC、FCER1G、C3AR1、C1QB、CYBB、FCGR2B、PLEK 和 MPEG1。其中TYROBP、PTPRC和C1QB在脊髓損傷發(fā)展機(jī)制的研究中有報(bào)道[25～28],但是關(guān)于這些分子的具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。C1QB為補(bǔ)體系統(tǒng)中的重要成分,相關(guān)研究表明,該分子參與了脊髓損傷后補(bǔ)體系統(tǒng)的激活,從而造成神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷[29～31]。除此之外,C1QB也參與了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)繼發(fā)性損傷的過程[32]。目前,關(guān)于ITGB2、FCER1G、C3AR1、CYBB、PLEK和MPEG1等基因在脊髓損傷發(fā)展機(jī)制中的研究很少有報(bào)道,本文的hub基因篩選結(jié)果為脊髓損傷發(fā)展機(jī)制的探究提供了新的思路。

KEGG分析結(jié)果顯示,TNF信號通路、NF-κB信號通路、趨化因子信號通路和NOD樣受體信號通路等在脊髓損傷部位激活。相關(guān)研究表明,TNF信號通路不僅參與脊髓損傷后的炎癥反應(yīng),也與脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān),提示TNF信號通路在脊髓損傷發(fā)展過程中有著重要的作用,阻斷該通路可能有助于繼發(fā)性脊髓損傷的治療[33～34],這與我們預(yù)測的結(jié)果相似。近年來,相關(guān)研究報(bào)道,NF-κB信號通路、趨化因子通路、NOD樣受體信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等信號通路在脊髓損傷發(fā)展機(jī)制中有著重要的作用[35～37],然而關(guān)于其機(jī)制的具體情況仍不清楚,很難為臨床治療提供指導(dǎo),因此對這些通路展開深層次的探究將有助于進(jìn)一步加深人們對脊髓損傷發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識。

為了補(bǔ)充差異基因篩選的不足,我們對所有基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了GSEA分析。通過GSEA分析預(yù)測得到 CCL2、FOS、CDK1、CCND1、IL1B 和BAX等關(guān)鍵基因,也預(yù)測到IL-17信號通路和p53信號通路。趨化因子CCL2是神經(jīng)損傷后釋放的一種損害性因子,主要參與局部炎癥和疼痛機(jī)制[38]。在脊髓損傷后,局部神經(jīng)細(xì)胞可通過高表達(dá)CCL2,促進(jìn)損傷部位的炎癥反應(yīng),從而降低神經(jīng)重塑的可能性,導(dǎo)致?lián)p傷的脊髓難以恢復(fù)[38～39]。FOS是一種疼痛刺激脊髓高表達(dá)的分子[40～41]。相關(guān)研究表明,神經(jīng)損傷后,表達(dá)cFOS的神經(jīng)元明顯減少[41～43],說明該分子可能參與脊髓損傷后的保護(hù)機(jī)制。CDK1主要參與脊髓損傷過程中的凋亡機(jī)制,抑制該分子可明顯減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,從而抑制繼發(fā)性脊髓損傷的發(fā)展,促進(jìn)脊髓損傷后的修復(fù)[44～45]。IL-1參與脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的機(jī)制早已被證明[46～47]。BAX是凋亡機(jī)制的標(biāo)志分子,大量文獻(xiàn)證明凋亡機(jī)制在脊髓損傷發(fā)展過程中有重要的作用。綜上所述,CCL2、FOS、CDK1、IL1B和BAX等基因在脊髓損傷發(fā)展機(jī)制中有重要的作用,這與我們的GSEA分析結(jié)果一致。而CCND1在脊髓損傷中的作用仍未證明,這為脊髓損傷機(jī)制的探究提供了新的方向,有助于發(fā)現(xiàn)脊髓損傷新的治療靶點(diǎn)。相關(guān)研究表明,IL-17信號通路參與了脊髓損傷后的炎癥反應(yīng),從而可以促進(jìn)繼發(fā)性脊髓損傷,并抑制脊髓損傷后的修復(fù)[48～49]。p53信號通路是腫瘤研究中的明星通路,我們通過GSEA分析,證明該通路在脊髓損傷發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要的作用,但是其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述,我們通過生物信息學(xué)的方法綜合分析了不同數(shù)據(jù)集中的基因芯片數(shù)據(jù),成功地預(yù)測 了 TYROBP、ITGB2、PTPRC、FCER1G、C3AR1、C1QB、CYBB、PLEK、MPEG1、CCL2、FOS、CDK1、CCND1、IL1B和BAX等有可能在脊髓損傷發(fā)展機(jī)制中產(chǎn)生重要作用的分子,同時(shí)也預(yù)測到TNF信號通路、NF-κB信號通路、趨化因子信號通路、NOD樣受體信號通路、IL-17信號通路和p53信號通路等可能與脊髓損傷發(fā)展機(jī)制關(guān)系密切,為脊髓損傷機(jī)制的研究提供了生物信息學(xué)支持。當(dāng)然,關(guān)于這些通路的具體機(jī)制,仍然需要大量的生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,這樣才能為我們對脊髓損傷發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識提供堅(jiān)實(shí)有力的證據(jù)。