張妍薇,鄭 皖,3,楊人貴,陳靜芳,向曉婧,陳繼華*

(1.中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院,中國湖南長沙410078；2.長沙市疾病預防控制中心,中國湖南長沙410002；3.遂寧市中心醫(yī)院,中國四川遂寧629099；4.長沙市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,中國湖南長沙410018)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,人民生活節(jié)奏加快,以心血管疾病、癌癥、慢性呼吸系統(tǒng)疾病和糖尿病為主的慢性病取代了傳染病的主要地位,成為了加重居民經(jīng)濟負擔,降低生活質(zhì)量的重要公共衛(wèi)生問題[1]。

大量研究表明,慢性病的發(fā)生發(fā)展與活性氧(reactive oxygen species,ROS)的過量緊密相關(guān)[2～3]。ROS是含氧化學反應分子,包括超氧陰離子(O2-·)、羥基自由基(·OH)及過氧化氫(H2O2)等。適量的ROS具有積極作用,包括參與殺死入侵的病原體、傷口愈合和修復過程。當機體受到紫外線、環(huán)境毒物、高氧、低氧等外界刺激時,細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的ROS,過量的ROS在不同的器官中如若不能被有效清除,則會造成積聚,此時高濃度的ROS會通過DNA損傷、脂質(zhì)過氧化或蛋白質(zhì)破壞等方式,對細胞造成持續(xù)性的破壞,引起氧化應激損傷,造成機體生理功能紊亂,從而導致疾病[4]。研究報道,在非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中,過量的ROS可抑制體內(nèi)抗氧化酶的活性,引起炎癥和細胞死亡,并對脂肪變性產(chǎn)生重要作用[5]。

非瑟酮(3,3′,4′,7-四羥基黃酮,fisetin)是一種廣泛存在于蔬菜水果中的黃酮類化合物。研究表明,fisetin具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保護心血管等多種生物學作用[6]。Seo等[7]發(fā)現(xiàn),fisetin可以通過誘導PI3K/AKT/Nrf2介導的血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達,抑制人角質(zhì)形成細胞HaCaT中TNF-α誘導的炎癥作用和H2O2誘導的氧化損傷。Sakai等[8]報道,fisetin可通過上調(diào)Nrf2介導的II期抗氧化酶的表達水平,阻斷核因子κB受體激活蛋白配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)介導的 ROS 產(chǎn)生,繼而抑制破骨細胞(osteoclasts,OCL)分化。然而,fisetin對HepG2細胞的氧化損傷保護作用及其機制尚不清楚。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗氧化反應的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[9]。大量關(guān)于Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/Nrf2/抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)通路的研究認為,在正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1相結(jié)合,經(jīng)泛素-蛋白酶體介導的調(diào)控機制,使Nrf2處于非游離及不斷降解的非活性狀態(tài)；在氧化應激條件下,Keap1對Nrf2的泛素化和降解能力減弱,Nrf2轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi),與ARE結(jié)合后可誘導下游二相解毒酶及抗氧化蛋白如醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)、HO-1等的表達,從而清除ROS,發(fā)揮其抗氧化作用[10]。已有研究表明,Nrf2所介導的細胞防御系統(tǒng)對氧化應激所誘發(fā)的疾病如癌癥[11]、糖尿病[12～13]、呼吸系統(tǒng)疾病[14]、慢性炎癥[15～16]、心血管疾病[17～18]以及神經(jīng)退行性疾病[19～20]等具有保護性作用。因此,Nrf2介導的抗氧化防御系統(tǒng)的激活是預防和治療這些疾病的有效策略。

本研究希望通過觀察fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞存活率及細胞內(nèi)ROS的影響,探究fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞的保護作用及其對ROS的清除效果；同時根據(jù)fisetin對Nrf2、Keap1、Ⅱ相酶表達水平的調(diào)控作用,探討fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

人肝癌細胞HepG2來自中南大學腫瘤研究所。

1.2 實驗儀器與主要試劑

CO2細胞培養(yǎng)箱(Binder公司,德國)；超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡AE2000(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；垂直電泳槽BE-240及轉(zhuǎn)膜儀BE-320(BioCraft公司,日本)；全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

Fisetin(Selleck公司,美國)；DMSO(Sigma公司,美國)；RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco公司,美國)；胎牛血清(Gibco公司,美國)；MTT試劑盒(Sigma公司,美國)；活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ROS熒光探針-DHE(威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液(強)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 3000試劑(Thermo Fisher Scientific公司,美國)；雙標記慢病毒載體GV248(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司)；胰酶(Genview公司,美國)；sh-Con質(zhì)粒(陰性對照,NC)、sh-Nrf2質(zhì)粒(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司)；PVDF 膜(Immobilon-P 公司,美國)；α-tubulin抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；Nrf2抗體(Abcam公司,英國)；Keap1抗體、HO-1抗體、NQO1抗體、GCLC抗體(Santa Cruz公司,美國)；辣根酶標記的山羊抗兔IgG、辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將HepG2細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.3.2 實驗分組

將HepG2細胞隨機分為空白對照組(control)、溶劑對照組(solvent control,培養(yǎng)基中加入體積分數(shù)為1‰的DMSO)、H2O2模型組(H2O2model group,培養(yǎng)基中加入 500 μmol/L H2O2處理 30 min)、fisetin干預組(培養(yǎng)基中先分別加入 10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L fisetin 處理 5.5 h,再加入 500 μmol/L H2O2處理30 min)、fisetin單獨處理組(培養(yǎng)基中加入30 μmol/L fisetin處理6 h)。實驗重復3次。

1.3.3 Nrf2敲低細胞系的構(gòu)建

委托上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司設(shè)計3條以Nrf2為靶點的shRNAs,依據(jù)該公司提供的定量PCR實驗結(jié)果篩選出相較于其他兩條敲低效率高(92.1%)的shRNA(ccggacTGACAGAAGTTGACAATTActcgagTAATTGTCAACTTCTGTCAgttttttg),認為其為有效靶點,并將其克隆到雙標記慢病毒載體GV248中。用Lipofectamine 3000將sh-Con(陰性對照)、sh-Nrf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中,兩天后加入嘌呤霉素,殺死未轉(zhuǎn)染的細胞。于湘雅醫(yī)院醫(yī)學科學研究中心采用流式細胞儀分選帶有綠色熒光的強陽性細胞。提取所分選的細胞蛋白質(zhì),通過Western-blot檢測Nrf2的表達情況,從而鑒定Nrf2敲低細胞系是否構(gòu)建成功。

1.3.4 MTT實驗

取對數(shù)生長期的HepG2細胞,以5×103個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,期間按1.3.2分組方法處理細胞,隨后換液加入MTT試劑(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。吸棄廢液,每孔加入150 μL DMSO使紫色結(jié)晶完全溶解,之后用酶標儀在490 nm波長下檢測吸光度值(OD值)。細胞存活率r=(ODs/ODd)×100%,式中,ODs與ODd分別為處理組與對照組的吸光度值。

1.3.5 ROS檢測

取對數(shù)生長期的HepG2細胞,以5×103個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,期間按1.3.2分組方法處理細胞,隨后換液,加入2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCFHDA)(10 μmol/L)反應 30 min。PBS 清洗一遍后,使用488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長,檢測細胞內(nèi)ROS的水平。

1.3.6 Western-blot檢測

取對數(shù)生長期的HepG2細胞,以1×106個/碟接種于6 cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h,期間按1.3.2分組方法處理細胞,隨后每碟加入200 μL RIPA裂解液,用刮刀刮下細胞,充分裂解后離心提取細胞總蛋白質(zhì),并用BCA法定量。根據(jù)定量結(jié)果統(tǒng)一濃度至10 μg/μL 后,加入 5× loading buffer混勻,100℃加熱10 min。用回收的蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),蛋白質(zhì)上樣量為30～50 μg,電泳參數(shù)設(shè)為恒壓80 V、2 h。切取含有目的蛋白的膠進行轉(zhuǎn)膜,參數(shù)設(shè)為恒壓80 V、1 h 30 min。5%脫脂牛奶封閉1 h后用1×TBST 洗滌 3 次；加入 Nrf2(1∶2 500)、Keap1(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)、GCLC(1∶1 000)、GCLM(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)抗體 4 ℃過夜；1×TBST洗滌3次；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h；1×TBST洗滌3次；ECL化學發(fā)光液顯色；采用Tanon全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)觀察和拍照,并用Tanon Gel Image System軟件對蛋白質(zhì)條帶進行定量分析。

1.3.7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)資料用平均值±標準差(x±s)表示,應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理,各組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),以Dunnettt檢驗比較各組間均數(shù)的差異,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 Fisetin和H2O2對HepG2細胞存活率的影響

課題組前期實驗結(jié)果顯示:用不同濃度的fisetin處理細胞24 h時,隨著fisetin濃度的增加,細胞存活率下降；當fisetin濃度為45.98 μmol/L時,細胞存活率為50%[9]。因此,本次實驗選用的fisetin 濃度為 10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L。為了探究fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞氧化損傷的保護作用,我們檢測了不同處理組細胞的存活率大小。結(jié)果如表1所示,與空白對照組相比,溶劑對照組的細胞存活率無明顯差異(100%&99.66%±0.34%,P＞0.05),fisetin單獨處理組的細胞存活率也無明顯差異(100%&98.67%±0.86%,P＞0.05),但H2O2模型組的細胞存活率顯著下降(100%&48.72%±1.19%,P＜0.05)；與 H2O2模型組相比,fisetin干預組的細胞存活率顯著上升(48.72%±1.19%&53.71%±1.51%,54.84%±1.59%,51.28%±0.20%,P＜0.05)。以上結(jié)果說明,在一定濃度范圍內(nèi),fisetin能夠?qū)2O2誘導的HepG2細胞氧化損傷起到保護性作用。

2.2 Fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞內(nèi)ROS的影響

為了進一步探究fisetin對H2O2誘導的Hep-G2細胞氧化損傷的保護作用,我們選用DCFHDA探針法檢測細胞內(nèi)ROS的水平。DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細胞膜,其進入細胞后,可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的 7′-二氯熒光素(7′-dichlorofluorescein,DCF)。因此,檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。圖1結(jié)果顯示,與空白對照組相比,H2O2模型組、fisetin單獨處理組中ROS的水平分別上升了約0.8、0.3 倍(P＜0.05)；與 H2O2模型組相比,fisetin干預組中ROS的水平分別下降了約7.1%、23.4%、30.5%(P＜0.05)。以上結(jié)果說明,在一定濃度范圍內(nèi),fisetin能夠抑制H2O2誘導的HepG2細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

表1 Fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞存活率的影響Table 1 Effect of fisetin on the survival rate of HepG2 cells induced by H2O2±s,n=3)

表1 Fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞存活率的影響Table 1 Effect of fisetin on the survival rate of HepG2 cells induced by H2O2±s,n=3)

注:*表示與空白對照組相比P＜0.05,#表示與H2O2模型組相比P＜0.05,圖1～3的統(tǒng)計分析相同。Notes:*P＜0.05,compared with the control group；#P＜0.05,compared with the H2O2model group.These are the same in the following Figs.1～3.

images/BZ_14_1282_568_2201_622.pngControl Solvent control H2O2model group Fisetin(10 μmol/L)+H2O2(500 μmol/L)Fisetin(20 μmol/L)+H2O2(500 μmol/L)Fisetin(30 μmol/L)+H2O2(500 μmol/L)Fisetin(30 μmol/L)100 99.66±0.34 48.72±1.19*53.71±1.51#54.84±1.59#51.28±0.20#98.67±0.86

圖1 Fisetin對H2O2誘導的HepG2細胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.1 Effect of fisetin on ROS in HepG2 cells induced by H2O2

2.3 Fisetin對Ⅱ相酶表達水平的影響

HO-1、GCLC、GCLM、NQO1是Ⅱ相抗氧化酶,能夠清除ROS,調(diào)控細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。為了探究fisetin對Ⅱ相抗氧化酶表達水平的影響,本研究檢測了 HO-1、GCLC、GCLM、NQO1蛋白的表達。圖2結(jié)果顯示,與空白對照組相比,用fisetin單獨處理后HO-1蛋白的表達水平顯著增加了約2.1倍(P＜0.05)；與H2O2模型組相比,fisetin干預組中HO-1蛋白的表達水平分別增加了約2.3、2.0、1.6 倍(P＜0.05)。然而,GCLC、GCLM、NQO1的表達水平在各組中并無明顯差異(P＞0.05)。

圖2 Fisetin對Ⅱ相酶表達水平的影響Fig.2 Effect of fisetin on phaseⅡenzyme expression

2.4 Fisetin對Nrf2、Keap1蛋白表達的影響

Nrf2是 HO-1、GCLC、GCLM、NQO1的上游轉(zhuǎn)錄因子,同時也是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗氧化反應的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。而Keap1被廣泛認為是Nrf2激活的中樞負調(diào)節(jié)劑。為了探討fisetin是否通過影響Nrf2/Keap1信號通路來發(fā)揮其抗氧化保護作用,我們通過Western-blot進一步檢測了Nrf2、Keap1蛋白的表達。圖3結(jié)果顯示,與空白對照組相比,H2O2模型組和fisetin單獨處理組中Keap1蛋白的表達水平分別下降了約16.6%、59.7%(P＜0.05),且fisetin單獨處理組中Nrf2蛋白的表達水平增加了約1.5倍(P＜0.05)；與H2O2模型組相比,干預組在20 μmol/L、30 μmol/L fisetin 處理時其 Nrf2 水平分別增加了 0.8、1.0倍(P＜0.05),在10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L fisetin處理時其Keap1水平分別下降了21.2%、23.6%、43.9%(P＜0.05)。以上結(jié)果說明,fisetin能夠增加Nrf2蛋白的表達水平,同時降低Keap1蛋白的表達水平。

2.5 Nrf2在fisetin清除ROS過程中的作用

上述結(jié)果顯示fisetin對HepG2細胞內(nèi)ROS的清除作用可能是通過增加Nrf2蛋白,激活Nrf2-ARE通路,誘導Ⅱ相酶表達等途徑發(fā)揮的。為了進一步驗證Nrf2在fisetin清除ROS過程中的作用,我們通過轉(zhuǎn)染sh-Nrf2質(zhì)粒,敲低了HepG2細胞中Nrf2的表達,并對細胞內(nèi)ROS的含量進行了測定。

圖3 Fisetin對Nrf2、Keap1蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of fisetin on Nrf2 and Keap1 expression

圖4A、4B結(jié)果顯示,與陰性對照組(sh-Con)相比,sh-Nrf2組中Nrf2蛋白的表達水平明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；而Keap1蛋白的表達水平變化不顯著,這說明Nrf2低表達細胞系構(gòu)建成功,可以進行后續(xù)實驗。圖4C結(jié)果顯示,兩種細胞系的熒光值在對照組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；H2O2模型組與對照組相比,兩種細胞系中的熒光強度均顯著增加(P＜0.01),其中sh-Con細胞系的熒光值增加了約0.8倍,sh-Nrf2細胞系的熒光值增加了約1.9倍；在H2O2模型組中,sh-Nrf2細胞系的熒光值顯著高于sh-Con細胞系的熒光值,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與H2O2模型組相比,20 μmol/L fisetin干預組中兩種細胞系的熒光值均顯著降低(P＜0.01),其中sh-Con細胞系的熒光強度降低了24.2%,sh-Nrf2細胞系的熒光強度僅降低了11.8%。這些結(jié)果說明,Nrf2缺失時H2O2誘導產(chǎn)生的ROS水平增加；Nrf2在fisetin清除細胞內(nèi)ROS的過程中起到關(guān)鍵性作用。

3 討論

慢性病具有難以治愈的特征,它不僅會降低人們的勞動能力與生活質(zhì)量,還會加重家庭與社會的經(jīng)濟負擔。據(jù)報道,ROS與超過200種臨床疾病的早期發(fā)生相關(guān),心血管疾病、癌癥、糖尿病和非酒精性脂肪肝等重大疾病均涵括其中[2]。因此,尋找一種能夠降低細胞內(nèi)ROS水平的物質(zhì),對疾病的預防具有重要意義。

圖4 Nrf2在fisetin清除ROS過程中的作用(A～B)sh-Nrf2細胞系中Nrf2蛋白的表達:(C)Fisetin對sh-Nrf2細胞中ROS的清除效果。**表示與空白對照組相比,P＜0.01；#表示與H2O2模型組相比,P＜0.01；&表示sh-Nrf2細胞H2O2模型組與sh-Con細胞H2O2模型組相比,P＜0.01；△表示sh-Nrf2細胞fisetin處理組與sh-Con細胞fisetin處理組相比,P＜0.01。Fig.4 The role of Nrf2 in scavening ROS by fisetin(A～B)Expression of Nrf2 in sh-Nrf2 cells；(C)Scavenging effect of fisetin on ROS in sh-Nrf2 cells.**P＜0.01,compared with the control group；#P＜0.01,compared with the H2O2model group；&P＜0.01,when the H2O2model group of sh-Nrf2 cells was compared with that of sh-Con cells；△ P＜0.01,when the fisetin treatment group of sh-Nrf2 cells was compared with that of sh-Con cells.

本研究將細胞暴露于H2O2中以增加ROS水平。H2O2是一種重要的活性氧分子,能夠引起細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多并造成細胞氧化損傷[21]。Ma等[22]選用 200 μmol/L H2O2作為 HepG2 細胞氧化應激與細胞毒性的誘導物,處理4 h后細胞存活率較空白對照組下降約49%。本研究結(jié)果表明,HepG2細胞經(jīng)500 μmol/L H2O2處理30 min后,細胞存活率較空白對照組下降約51%,且細胞內(nèi)ROS增加。將fisetin干預組與H2O2模型組進行比較,發(fā)現(xiàn)fisetin能夠提高細胞存活率并抑制細胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生(表 1、圖 1)。Yen 等[23]發(fā)現(xiàn),fisetin(＜20 μmol/L)可恢復細胞活力并抑制衣霉素(tunicamycin,TM)處理引起的細胞凋亡、自噬和ROS產(chǎn)生。這與我們的研究結(jié)果相一致。然而,本研究發(fā)現(xiàn)單獨用fisetin(30 μmol/L)處理時,ROS水平高于空白對照組,這可能與高濃度的fisetin誘導ROS產(chǎn)生有關(guān)。相關(guān)報道稱,高濃度的fisetin(50 μmol/L)在人口腔癌細胞SCC-4中能夠誘導產(chǎn)生大量的ROS,降低線粒體膜電位,引起細胞凋亡[24]。此外,高濃度的fisetin(50 μmol/L)可抑制人胃癌細胞AGS和SUN-1的增殖,并誘導其ROS生成增加,產(chǎn)生細胞毒性[25]。因此,將來對于fisetin的開發(fā)利用仍需更多的體內(nèi)外實驗進行深入探究。

現(xiàn)有研究表明,多種黃酮類化合物如槲皮素[26]、白藜蘆醇[27]、黃腐酚[28]等都是 Nrf2 的激活劑,可對Nrf2及Keap1的表達起調(diào)控作用。Zhang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)fisetin可通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制Nrf2的降解,使其發(fā)生核易位,并上調(diào)下游HO-1的表達。這為fisetin作為Nrf2激活劑的研究提供了理論依據(jù)。Nrf2/Keap1信號通路是機體內(nèi)重要的抗氧化通路之一,該通路的激活能夠誘導多種Ⅱ相抗氧化酶的表達。目前,關(guān)于Nrf2/Keap1途徑的機制學說有很多,基本可以分為兩種,即Keap1依賴性和Keap1非依賴性。在Keap1依賴性調(diào)節(jié)Nrf2-ARE途徑的學說中,Keap1被廣泛認為是Nrf2激活的中樞負調(diào)節(jié)劑[29]。在我們的研究中,fisetin能夠上調(diào)Nrf2的表達,而下調(diào)Keap1的表達(圖3)；通過在Nrf2敲低細胞系中驗證fisetin對ROS的清除效果發(fā)現(xiàn),Nrf2在fisetin清除細胞內(nèi)ROS的過程中具有關(guān)鍵性作用(圖4C)；同時,在一定濃度范圍內(nèi),GCLC、GCLM、NQO1的表達水平在各組中雖并無明顯差異,但HO-1蛋白的表達水平有顯著增加(圖2),提示fisetin在HepG2細胞中可通過激活Keap1/Nrf2/ARE通路來促進HO-1的表達,從而降低細胞內(nèi)ROS的水平。

綜上所述,fisetin可通過激活Keap1/Nrf2/ARE通路來誘導HO-1的表達,降低細胞內(nèi)ROS水平,從而在抗氧化損傷過程中發(fā)揮細胞保護作用。