韋慧，吳超權(quán)，夏星，鐘振國,*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實驗中心，南寧 530200 2. 廣西食品藥品檢驗所，南寧 530021

石墨烯(graphene)是由碳原子以sp2雜化方式形成的納米晶體，是一種蜂窩狀單層二維平面結(jié)構(gòu)的新型納米材料[1]。氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是一種石墨烯的含氧衍生物，與石墨烯相比較，GO具有較大的表面積，良好的水分散性，更好的生物相容性，更強(qiáng)的表面活性[2]。GO獨(dú)特的物理特性，使其在光電子[3]、太陽能電池[4]、水處理[5]、醫(yī)學(xué)[6]、環(huán)境能源[7]及功能材料[8]等多個領(lǐng)域具有潛在的發(fā)展前景。GO能夠廣泛應(yīng)用的重要前提是其具有可靠的生物安全性，而目前GO在生產(chǎn)、使用或廢棄時進(jìn)入自然環(huán)境后，是否存在生物安全性尚有爭議。大多數(shù)研究者認(rèn)為GO對細(xì)菌有毒性作用，但是在細(xì)胞和生物整體水平的毒性研究還存在分歧。GO與生物體之間的相互作用還不甚明確，如毒性、炎癥反應(yīng)、病理變化和體內(nèi)清除等尚未有一致的結(jié)果[9]。GO的潛在致癌和致畸作用的評估，是對其安全性評價中極為重要的一環(huán)。已有研究發(fā)現(xiàn)，GO的遺傳毒性指數(shù)表現(xiàn)為各種類型的染色體畸變，表現(xiàn)出劑量和時間依賴性，特別是在GO暴露時間長、劑量高時，染色體畸變顯著增加[10]。但是目前對GO的遺傳毒性的研究仍較為匱乏。筆者根據(jù)《納米毒理學(xué)與安全性研究方法》[11]，選用了Ames試驗、體外CHL細(xì)胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗進(jìn)行GO的遺傳毒性研究，考察其潛在的致突變作用，為GO的安全使用提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

氧化石墨烯(GO)棕黑色溶液，生產(chǎn)批號D160330C2A。由常州第六元素材料科技公司提供。取GO樣品于121 ℃下高壓滅菌30 min，無菌操作下加入超純水稀釋成相應(yīng)濃度后超聲2 h制備成穩(wěn)定的水分散液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

胰蛋白胨(批號：3206105)、瓊脂粉(批號：3206098)均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；D(+)-生物素(批號：20171123)、L-組氨酸(批號：20171013)和牛肉浸膏(批號：20171023)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；凍干型S9混合液(批號：3480)購自Molecular Toxicology公司；1640培養(yǎng)基(批號：8118264)、胎牛血清(FBS)(批號：1620769)購自Gibco公司；Hank’s液(批號：20170623)、0.25%胰蛋白酶(批號：20170505)和吉姆薩染液(批號：20161229)均購自北京索萊寶科技有限公司；絲裂霉素(MMC)(批號：12/2017)、環(huán)磷酰胺(批號：12/2017)和秋水仙堿(批號：12/2017)均購自Roche公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗儀器

HERAcell 150i型CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)；DM500型倒置相差顯微鏡(LEICA)；Infinite M200 PRO型酶標(biāo)儀(瑞士帝肯)；AC-4S1型生物安全柜(ESCO Class II BSC)；HH-8型電熱恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；Neofuge23R型低溫高速離心機(jī)(Heal Force)。

1.3 實驗菌株

選用鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株TA-97a、TA-98、TA-100和TA-102進(jìn)行試驗。菌株均來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由廣西食品藥品檢驗所提供。按照試驗要求，這些菌株經(jīng)過組氨酸需求試驗、結(jié)晶紫敏感試驗、抗氨芐青霉素試驗、抗四環(huán)素試驗、紫外線敏感試驗和自發(fā)回變試驗鑒定，菌株基因型均符合試驗要求。37 ℃震蕩培養(yǎng)16 h，計數(shù)生長細(xì)菌不少于1×109cells·mL-1活菌方可使用。S9為體外代謝活化系統(tǒng)。

1.4 實驗細(xì)胞

CHL細(xì)胞，來源于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫，由廣西食品藥品檢驗所提供。完全培養(yǎng)液為含10%小牛血清的1640，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.5 實驗動物

SPF級昆明雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由廣西食品藥品檢驗所提供。實驗動物許可證號：SYXK(桂) 2017-002。小鼠飼養(yǎng)于廣西食品藥品檢驗所SPF動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度55%±15%，換氣次數(shù)10～20 次·h-1。

1.6 實驗方法

1.6.1 Ames試驗

將0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL GO溶液和0.5 mL S9混合液(當(dāng)需要代謝活化時)混合，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上。設(shè)0.080、0.040、0.020、0.010和0.005 mg·mL-15個劑量組，同時設(shè)自發(fā)回復(fù)突變和陽性突變劑對照組，陽性對照藥物如表1所示，每組3個平行皿，37 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)各平板菌落數(shù)并算出均值，重復(fù)試驗一次。

1.6.2 染色體畸變試驗

根據(jù)前期用MTT法測GO對CHL的細(xì)胞毒性時發(fā)現(xiàn)，GO對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度，-S9組為0.415 mg·mL-1，+S9組為0.767 mg·mL-1。故+S9組加入1.000、0.500和0.250 mg·mL-1GO，而-S9組加入0.50、0.250和0.125 mg·mL-1GO，陰性對照(1640)和陽性對照(+S9：環(huán)磷酰胺0.020 mg·mL-1、-S9：絲裂霉素0.001 mg·mL-1)。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)前加入秋水仙堿(0.001 mg·mL-1)處理2 h。制片程序依次為：胰蛋白酶液消化；離心；低滲液低滲；固定液固定，離心；重復(fù)1次；滴片；干燥；10% Giemsa染色。各組觀察100個中期分裂相細(xì)胞，計數(shù)其染色體畸變率。

1.6.3 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，每組10只。根據(jù)前期試驗測得GO對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為6.364 mg·kg-1。分別設(shè)置為1.000、0.500、0.250和0.125 mg·kg-1GO共4個劑量組，同時設(shè)陰性對照和陽性對照組(環(huán)磷酰胺40 mg·kg-1)，每周尾靜脈注射(i.v.)一次，小鼠于28 d處死。各組動物處死前4 h腹腔注射秋水仙素(4 mg·kg-1)。處死后，取股骨，制備骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本。每一處理組每只動物選擇100個分散良好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行分析，分別記錄各組染色體畸變類型和數(shù)目，計算畸變率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。統(tǒng)計描述采用x±s，多組間比較采用單因素方差分析，率間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 GO的表征

圖1 氧化石墨烯(GO)的表征((a)：TEM；(b)：FTIR)Fig. 1 Characterization of graphene oxide (GO) ((a): TEM; (b): FTIR)

表1 Ames試驗陽性對照藥物Table 1 The positive control drug in Ames test

2.2 Ames試驗檢測GO的致突變作用

計算同一菌株同一劑量組的3個平行培養(yǎng)皿上的平均菌落數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(表2)，結(jié)果顯示：無論是否添加S9活化體系，GO各劑量組對TA-97a、TA-98、TA-100和TA-102菌株的回變均無顯著影響，各菌株回復(fù)突變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)；各劑量組與陰性對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)比較差異不顯著(P>0.05)，并且顯著地低于陽性對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)(P<0.01)，Ames試驗結(jié)果均呈陰性。

2.3 GO對CHL細(xì)胞的致突變作用

經(jīng)S9活化體系處理(+S9)的GO染色體畸變結(jié)果如表3所示，通過卡方檢驗進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，隨GO濃度的增加，CHL細(xì)胞染色體畸變率也升高，有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。其中，GO的+S9劑量組(1.000 mg·mL-1)與陰性對照組相比，畸變率顯著升高(P<0.05)。

表2 GO的Ames試驗結(jié)果Table 2 Ames test results of GO

注：-S9表示平皿中沒有添加S9，+S9表示平皿中添加S9；與陰性對照組比較，**為差異顯著(P<0.01)。
Note: -S9means S9was not added in the petri dish, and +S9means S9was added in the petri dish; compared with the negative control group, ** showed a significant difference (P<0.01).

注：與陰性對照組比較，*為差異顯著(P<0.05)。
Note: Compared with the negative control group, *showed a significant difference (P<0.05).

未經(jīng)S9活化體系處理(-S9)的GO染色體畸變結(jié)果如表4所示。隨GO濃度的增加，CHL細(xì)胞染色體畸變率也升高，有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。其中，0.500 mg·mL-1劑量組與陰性對照組相比，畸變率顯著升高(P<0.05)。

GO致CHL細(xì)胞染色體畸變類型如圖2所示。染色體的斷裂，可進(jìn)一步造成染色體的缺失或各種重排，由此而產(chǎn)生的染色體結(jié)構(gòu)異常稱為染色體結(jié)構(gòu)畸變。正常CHL細(xì)胞染色體未見明顯突變(圖2(a))；1.000 mg·mL-1GO組出現(xiàn)染色體斷裂(圖2(b))；0.500 mg·mL-1GO組出現(xiàn)染色體粉碎化(圖2(c))；0.125 mg·mL-1GO組出現(xiàn)染色體缺失(圖2(d))；陽性組出現(xiàn)染色體交換、多倍體及環(huán)狀染色體(圖2(e))。染色體結(jié)構(gòu)畸變觀察表明，GO引起的染色體畸變類型主要為斷裂和缺失。

2.4 GO對小鼠骨髓細(xì)胞染色體的致畸變作用

骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗結(jié)果如表5所示。通過卡方檢驗進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，1.000 mg·kg-1劑量組細(xì)胞畸變率與陰性對照組相比，畸變率顯著升高(P<0.01)，0.500 mg·kg-1劑量組細(xì)胞畸變率顯著高于陰性對照組(P<0.05)。0.250和0.125 mg·kg-1劑量組細(xì)胞畸變率均略高于陰性對照組，但與陰性對照組的差異不顯著(P>0.05)。

圖2 GO致CHL細(xì)胞染色體畸變圖注：(a). 陰性對照組CHL細(xì)胞染色體；(b). 1.000 mg·mL-1 GO組染色體斷裂；(c). 0.500 mg·mL-1 GO組染色體粉碎化；(d). 0.125 mg·mL-1 GO組染色體缺失；(e). 陽性組染色體交換、多倍體、環(huán)狀染色體；Giemsa染色，×100。Fig. 2 Chromosome aberration diagram of CHL cells induced by GONote: (a). normal CHL cell chromosome; (b). 1.000 mg·mL-1 GO group chromosome break; (c). 0.500 mg·mL-1 GO group chromosome pulverization; (d). 0.125 mg·mL-1 GO group chromosome deletion; (e). positive group chromosome exchange, polyploidy and circular chromosome; Giemsa staining, ×100.

表4 GO對CHL細(xì)胞染色體畸變的影響(-S9，24 h)Table 4 Effect of GO on chromosomal aberrations in CHL cells (-S9, 24 h)

注：與陰性對照組比較，*為差異顯著(P<0.05)。
Note: Compared with the negative control group, * showed a significant difference (P<0.05).

表5 GO對小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率的影響Table 5 Effect of GO on chromosome aberration rate of mouse bone marrow cells

注：與陰性對照組比較，*為差異顯著(P<0.05)，**為差異顯著(P<0.01)。
Note: Compared with the negative control group, *showed a significant difference (P<0.05); *showed a significant difference (P<0.01).

GO致小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變類型如圖3所示。陰性對照組小鼠骨髓細(xì)胞染色體未見明顯畸變發(fā)生(圖3(a))；1.000 mg·kg-1GO組出現(xiàn)染色體缺失(圖3(b))；0.500 mg·kg-1GO組出現(xiàn)染色體斷裂(圖3(c))；環(huán)磷酰胺組出現(xiàn)染色體粉碎、交換和多倍體染色體(圖3(d))。染色體結(jié)構(gòu)畸變觀察表明，GO所致染色體畸變類型以染色體斷裂為主。

3 討論(Discussion)

GO獨(dú)特的理化性質(zhì)及其與生物體相互作用特性為其提供了廣泛的應(yīng)用前景，它的安全性評價成為研究的熱點(diǎn)[12]。目前，關(guān)于GO毒性的研究主要集中在其細(xì)胞毒性方面。大量體外研究發(fā)現(xiàn)，GO通過以下幾種途徑產(chǎn)生毒性：通過與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的相互作用或由于生物分子的吸附而產(chǎn)生的間接毒性；產(chǎn)生活性氧物質(zhì)或直接物理毒性，促進(jìn)細(xì)胞毒性；由于疏水表面，石墨烯可以與細(xì)胞膜脂質(zhì)顯著相互作用，引起細(xì)胞毒性[13]。此外，GO的細(xì)胞毒性與其自身的物理化學(xué)性質(zhì)(大小、形狀和表面官能團(tuán)等)、作用的細(xì)胞種類以及作用濃度等有著密不可分的關(guān)系[14]。Zhang等[15]通過放射性元素給GO做標(biāo)記，并使用放射性示蹤法研究小鼠體內(nèi)的GO的代謝和分布。注射10 mgkg-1GO到小鼠后發(fā)現(xiàn)，其通過血液循環(huán)大量積聚在肺，其次分布在肝中，保留時間較長，同時觀察到炎癥細(xì)胞浸潤，肉芽腫和肺水腫的形成[14]。遺傳毒性試驗主要用于致癌性預(yù)測，而目前在體外細(xì)胞水平上的GO遺傳毒性研究少有報道。如Chng和Pumera[16]研究發(fā)現(xiàn)，GO能誘導(dǎo)人肺成纖維HLF細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞毒性呈現(xiàn)濃度依賴性，尾長和尾DNA百分比的增加揭示出GO具有遺傳毒性。Stueckle等[17]的彗星試驗結(jié)果表明，nano-GO誘導(dǎo)肺部細(xì)胞(A549)的DNA損傷有很大作用。Mohamed等[18]發(fā)現(xiàn)，GO可以引起DNA的遷移，引起DNA損傷，導(dǎo)致DNA片段化。Bengtson等[19]將單次氣管內(nèi)暴露于GO和還原氧化石墨烯(rGO)后，發(fā)現(xiàn)GO和rGO分別在不同時間點(diǎn)可誘導(dǎo)肺、肝DNA損傷。此外，非片層結(jié)構(gòu)的石墨烯同樣被發(fā)現(xiàn)有一定的遺傳毒性，如Kim等[20]采用Ames試驗、體外染色體畸變試驗和小鼠骨髓微核試驗對單臂碳納米管(SWCNT)的遺傳毒性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，Ames試驗未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌回變現(xiàn)象，微核試驗結(jié)果為陰性，體外染色體畸變試驗為陽性且額外觀察到了細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象，故認(rèn)為SWCNT的遺傳毒性為弱陽性?？梢奊O及在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步衍生化的石墨烯類材料的遺傳毒性不容忽視。

圖3 GO致小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變圖注：(a). 小鼠骨髓細(xì)胞正常染色體；(b). 1.000 mg·kg-1 GO組染色體斷裂；(c). 0.500 mg·kg-1 GO組染色體缺失；(d). 環(huán)磷酰胺組染色體粉碎、交換、多倍體染色體；Giemsa染色，×100。Fig. 3 Chromosome aberrations of mouse bone marrow cells induced by GONote: (a). mouse bone marrow cells normal chromosome; (b). 1.000 mg·kg-1 GO group chromosome break; (c). 0.500 mg·kg-1 GO group chromosome deletion; (d). cyclophoshamide group chromosome smashing, chromosome exchange and ploidy chromosome; Giemsa staining, ×100.

Ames從基因水平上反映了遺傳物質(zhì)受損傷情況；染色體畸變的產(chǎn)生與染色體斷裂及紡錘體受損有關(guān)。依據(jù)《納米毒理學(xué)與安全性研究方法》[11]，針對遺傳物質(zhì)作用終點(diǎn)的不同，并兼顧體外和體內(nèi)試驗的配套原則，筆者采用Ames試驗、CHL細(xì)胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓細(xì)胞染色體試驗，綜合分析這3種試驗的結(jié)果，以研究GO的致突變作用。本研究結(jié)果顯示，不管是否加入活化系統(tǒng)(S9)，GO各劑量組對TA-97a、TA-98、TA-100和TA-102這4種菌株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響均在正常范圍內(nèi)，與陰性對照組相比無顯著性差異，提示GO在體外Ames試驗中無致突變作用。但是在細(xì)胞水平和體內(nèi)水平的染色體畸變試驗中，隨著GO濃度的增加，染色體畸變率顯著升高，有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，提示GO在體內(nèi)外的染色體畸變試驗中具有潛在的遺傳毒性。已有研究發(fā)現(xiàn)，與嚙齒類動物腫瘤相關(guān)度最高的傳統(tǒng)Ames試驗無法有效檢出納米粒子的潛在致突變性，而體外微核試驗、染色體畸變試驗及彗星試驗卻通?？梢缘玫疥栃越Y(jié)果[21]。這與本研究結(jié)果一致，即GO的Ames致突變性試驗結(jié)果呈陰性，但染色體畸變試驗結(jié)果卻呈陽性。進(jìn)一步分析導(dǎo)致Ames試驗無法準(zhǔn)確評價納米粒子的致突變作用的原因可能在于：(1)傳統(tǒng)的Ames試驗使用固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為堿性環(huán)境，固態(tài)且?guī)Т罅控?fù)電荷的培養(yǎng)條件限制細(xì)菌與納米粒子充分接觸；(2)菌壁與哺乳動物細(xì)胞壁有差異，加之革蘭氏陰性菌的菌壁較厚，可導(dǎo)致納米材料不易穿透胞壁，與細(xì)菌接觸不充分，限制納米粒子被細(xì)胞攝?。?3)另外，有些納米材料具有一定的滅菌作用[22]。

目前沒有任何單一的試驗方法可同時涵蓋所有遺傳終點(diǎn)。為全面考察GO的潛在遺傳毒性風(fēng)險，通常需開展一系列機(jī)制上互相補(bǔ)充的試驗，對GO的遺傳毒性及其作用機(jī)制，可進(jìn)一步研究和探討。