譚蓉 ， 張穎聰 ， 王靜 ， 張志騰 ， 楊秀芳 *

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016；3.安溪縣穎昌茶廠，福建安溪 362400）

安溪肉桂產(chǎn)自安溪縣大坪鄉(xiāng)坪洲村。民間對(duì)肉桂茶清咽利喉的效果反饋良好，為了驗(yàn)證這一特殊功效，文章擬通過體內(nèi)外試驗(yàn)進(jìn)行功效評(píng)價(jià)研究。以細(xì)菌感染引起的急慢性咽炎為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行安溪肉桂的體外抑菌試驗(yàn)研究，同時(shí)以《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003）的要求進(jìn)行大鼠棉球植入試驗(yàn)和大鼠足趾腫脹試驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)安溪肉桂清咽保健功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 體外抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)菌種：普通變形桿菌 CMCC（B）49027，肺炎鏈球菌ATCC49619，乙型溶血性鏈球菌ATCC21059，上海魯微科技有限公司。

試驗(yàn)樣品：穎昌牌安溪肉桂干茶樣（茶多酚總量14.8%，兒茶素總量7.8%），安溪縣穎昌茶廠提供。

試驗(yàn)試劑：甲醇、無水乙醇、氯化鈉、濃硫酸、氯化鋇，均為分析純；營養(yǎng)瓊脂，血瓊脂平板。

1.1.2 體內(nèi)功效評(píng)價(jià)

試驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，清潔級(jí)，80只，體重160～180 g。購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0008677，許可證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033）。于室溫 23±2 ℃，相對(duì)濕度 50%～70%飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

試驗(yàn)樣品：穎昌牌安溪肉桂提取濃縮液，1 g/mL，分別用蒸餾水稀釋5倍、10倍和20倍，配制成濃度為0.2 g/mL、0.1 g/mL和0.05 g/mL的藥液備用。

陽性對(duì)照：清熱散結(jié)膠囊（江西普正制藥有限公司，批號(hào) 150508）；規(guī)格：0.35 g×12 ?！? 板，根據(jù)人用劑量和動(dòng)物劑量換算，將膠囊內(nèi)含物用蒸餾水配制成濃度為63 mg/mL溶液備用。

致炎劑：用生理鹽水稀釋雞蛋清配成濃度為10%的蛋清溶液。

試驗(yàn)試劑：TNF-α ELISA試劑盒，批號(hào)20151102B，上海源葉生物科技有限公司；IL-6 ELISA試劑盒，批號(hào)20151102B，上海源葉生物科技有限公司；IL-1β ELISA試劑盒， 批號(hào)20151102B，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL-204型電子天平；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SYQDSX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱；YLS-7A型足趾容量測量儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；Powerwave 340酶標(biāo)儀，美國Bio-TEK公司；DGG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CP114電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；Hirayama HVP-50高壓滅菌鍋，日本Hirayama；Heraeus Biofuge Stra冷凍離心機(jī)，德國Heraeus；DS-671電子計(jì)重秤，上海寺岡電子有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紙片抑菌法

參考WS/T 125—1999《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行試驗(yàn)，其中部分步驟稍微修改，具體如下：

使用劃線法活化菌株，選擇平板上形態(tài)相同的菌落至少4～5個(gè)，用接種環(huán)挑起，移至5 mL的生理鹽水中，將菌液濃度調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁?。使用無菌棉簽，蘸取菌液，并在上端管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多菌液，用棉簽涂布平板表面，保證涂布均勻。空白藥敏紙片（直徑6 mm）在提取液中浸泡1 h后，37℃下烘干，用于下一步的抑菌試驗(yàn)。接種平板后，貼上已經(jīng)制備好的藥敏紙片，用鑷子壓一下紙片使其與培養(yǎng)基表面貼牢，每塊培養(yǎng)基貼6片。隨后將平板倒置放在35.5℃的生化培養(yǎng)箱中。經(jīng)16～18 h培養(yǎng)后觀察結(jié)果，測量抑菌圈大小，平行3次。

1.3.2 動(dòng)物試驗(yàn)方法

（1）分組與給藥

選取健康雄性SD大鼠40只，按體重隨機(jī)分為5組，每組8只，即陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組（清熱散結(jié)膠囊0.63 g/kg）、安溪肉桂提取物（0.5 g/kg）組、安溪肉桂提取物（1 g/kg）組、安溪肉桂提取物（2 g/kg）組。所有大鼠均給予基礎(chǔ)飼料，自由采食飲水。除陰性對(duì)照組灌服純凈水外，其余各給藥組分別灌服相應(yīng)藥物，每日1次，按1 mL/100 g體重的標(biāo)準(zhǔn)，足趾腫脹模型連續(xù)給藥29 d，棉球肉芽腫模型連續(xù)給藥40 d。

（2）指標(biāo)測定

足趾腫脹度測定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束灌服1 h后，將大鼠固定，于足外踝處畫1道橫線作標(biāo)記。用容積測量法測足趾容積，將大鼠后肢拉直放入測量儀玻璃筒內(nèi)，觀察筒內(nèi)液體水平線與鼠足橫線標(biāo)記處重疊時(shí)，測量儀數(shù)字顯示屏將顯示足趾容積數(shù)值（mL）。給藥前先測一次足趾容積；給藥后0.5 h，自足趾中部皮下注入致炎劑（10%蛋清）0.1 mL/只；分別于致炎 1 h、2 h、4 h、6 h后測量大鼠足趾腫脹程度。足趾腫脹度（mL）=給藥后足趾體積-給藥前足趾體積。

棉球肉芽腫重量測定：將脫脂棉制成約20 mg左右緊致的小棉球，經(jīng)高壓滅菌后，置恒溫干燥箱60°C干燥3 h，取出在無菌條件下稱重，干燥保存，備用。肉芽腫的形成和測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束前8 d，用脫毛器脫去大鼠兩側(cè)腹股溝處的毛，水合氯醛麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側(cè)腹股溝皮膚，植入備用的棉球，縫合切口，繼續(xù)給予樣品。末次給藥后禁食12 h，水合氯醛麻醉大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，恒溫干燥箱60°C干燥3 h后稱重，計(jì)算肉芽腫凈量。

肉芽腫凈量 （mg）=干燥后棉球肉芽腫重量-原棉球重量。

（3）炎癥因子測定

末次給藥后禁食12 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心制備血清，酶聯(lián)免疫法測定血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性分析，使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±SD表示，組間比較采用 t-test，p＜0.05表示差異有顯著性。

表1 不同提取溶劑對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 1 Influence of different extraction solvents on disc diffusion zone diameters （Unit：mm，±SD ）

表1 不同提取溶劑對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 1 Influence of different extraction solvents on disc diffusion zone diameters （Unit：mm，±SD ）

注：不同字母表示存在顯著性差異，p＜0.05；-表示不抑菌，下同。Note： different letters indicated significant differences， p＜0.05.“-” indicated no bacteriostasis， the same as followed.

提取溶劑E x t r a c t i o n s o l v e n t乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s水--7.7 5±0.3 5 c普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 7 0%乙醇 - 9.6 7±0.2 9 b 9.8 0±0.2 7 b 7 0%甲醇 - 1 0.4 0±0.5 5 a 1 0.8 3±0.7 6 a

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)抑菌圈大小的影響

分別選擇水、70%甲醇及70%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶4（w/v）（此處由于水作為溶劑時(shí)，提取料液比最高只能達(dá)到1∶4，再提高時(shí)基本沒有提取液），提取時(shí)間為20 min，提取溫度為70℃。三種提取溶劑所獲得的提取液抑菌效果如表1所示。由上表可知，70%甲醇提取液的抑菌效果較佳。隨后，又進(jìn)行了不同濃度的甲醇提取液對(duì)抑菌效果的研究，料液比為 3∶10（w/v），其余提取條件一致，結(jié)果如表2所示。從結(jié)果可以看出，隨著甲醇濃度的增加，對(duì)三種菌的抑菌圈大小均呈先增大后減小的趨勢，且在70%的甲醇條件下，抑菌效果最佳。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇70%甲醇作為提取溶劑。

表2 不同濃度的甲醇對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 2 Influenceofdifferentconcentrationsofmethanolondiscdiffusionzonediameters （Unit： mm，±SD）

表2 不同濃度的甲醇對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 2 Influenceofdifferentconcentrationsofmethanolondiscdiffusionzonediameters （Unit： mm，±SD）

甲醇濃度M e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 6 0%甲醇 7.0 0±0.0 0 a 9.2 5±0.3 5 b 9.7 5±0.3 5 b 7 0%甲醇 7.2 5±0.3 5 a 1 0.5 0±0.7 1 a 1 1.7 5±0.3 5 a 8 0%甲醇9 0%甲醇普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e- -9.0 0±0.0 0 b-9.2 5±0.3 5 b 8.0 0±0.0 0 c

2.1.2 提取溫度對(duì)抑菌圈大小的影響

分別選擇60℃、70℃、80℃和90℃為提取溫度，料液比為 3∶10（w/v），提取時(shí)間為 20 min，考察相應(yīng)提取液抑菌圈的大小，結(jié)果如表3所示.從結(jié)果可以看出，70℃和90℃提取時(shí)提取液抑菌圈最大，且與另外兩個(gè)提取溫度下提取液的抑菌圈大小均存在顯著性的差異（p＜0.05）。綜合考慮，后續(xù)使用70℃作為提取溫度。

表3 不同提取溫度對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 3 Influence of different extraction temperatures on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

表3 不同提取溫度對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 3 Influence of different extraction temperatures on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

溫度T e m p e r a t u r e乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 6 0 ℃ - 7.7 5±0.3 5 b 8.5 0±0.0 0 b 7 0 ℃ 7.2 5±0.3 5 b 1 0.5 0±0.7 1 a 1 1.1 7±0.2 9 a 8 0℃9 0℃普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e-9.2 5±0.3 5 a 7.7 5±0.3 5 b 9.2 5±0.3 5 a 8.7 5±0.3 5 b 1 1.5 0±0.7 1 a

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)抑菌圈大小的影響

分別選擇 5 min、10 min、20 min 和 30 min 為提取時(shí)間，料液比為 3∶10（w/v），考察相應(yīng)提取液抑菌圈的大小，結(jié)果如表4所示，從表中可以看出，提取時(shí)間在20 min時(shí)，對(duì)三種菌的抑菌圈效果較好，且與30 min的結(jié)果沒有顯著性的差異。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇20 min作為提取時(shí)間。

表4 不同提取時(shí)間對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 4 Influence of different extraction time on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

表4 不同提取時(shí)間對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 4 Influence of different extraction time on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 5 m i n - 8.7 5±0.3 5 b 9.7 5±0.3 5 b 1 0 m i n - 9.5 0±0.5 0 b 9.8 3±0.2 9 b 2 0 m i n 3 0 m i n時(shí)間T i m e普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 7.2 5±0.3 5 a 7.3 3±0.2 9 a 1 0.5 0±0.7 1 a b 1 0.7 5±0.3 5 a 1 1.1 7±0.2 9 a 1 1.2 5±0.3 5 a

2.1.4 不同料液比對(duì)抑菌圈大小的影響

根據(jù)上述獲得的較優(yōu)提取條件，考察不同料液比對(duì)三種菌的抑菌效果，結(jié)果如表5所示，從結(jié)果中可以看出，抑菌圈的大小都隨著料液比的增加而增大。當(dāng)料液比達(dá)到3.5∶10后，三種菌的抑菌圈均不再顯著增加（p＜0.05）。但是三種菌的最佳料液比有一定的差異，以最先出現(xiàn)顯著性差異的結(jié)果為最佳比例，普通變形桿菌為3.5∶10，肺炎鏈球菌為 2.5∶10，乙型溶血性鏈球菌為 3∶10。

表5 不同料液比對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 5 Influence of different solid-liquid ratio on disc diffusion zone diameters(Unit:mm,±SD)

表5 不同料液比對(duì)抑菌圈大小的影響（單位：mm，±SD）Table 5 Influence of different solid-liquid ratio on disc diffusion zone diameters(Unit:mm,±SD)

料液比S o l i d-L i q u i d r a t i o乙型溶血性鏈球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 1∶1 0 - - -1.5∶1 0 2∶1 0普通變形桿菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎鏈球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e---9.2 5±0.3 5 b 8.2 5±0.3 5 c 1 0.2 5±0.3 5 b 2.5∶1 0 3∶1 0 3.5∶1 0 4∶1 0-7.2 5±0.3 5 b 7.6 7±0.2 9 a 8.6 7±0.2 9 a 1 0.4 0±0.5 5 a 1 0.5 0±0.7 0 a 1 0.1 0±0.2 2 a 1 0.5 0±0.5 0 a 1 0.8 3±0.7 a b 1 1.1 7±0.2 9 a 1 1.4 0±0.2 2 a 1 1.5 0±0.5 0 a

綜上，安溪肉桂對(duì)三種菌均有一定的抑制效果，其中對(duì)乙型溶血型鏈球菌的抑制效果最佳，其次是肺炎鏈球菌，對(duì)普通變形桿菌的抑制效果較弱。

2.2 動(dòng)物體內(nèi)功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)

2.2.1 大鼠足趾腫脹試驗(yàn)結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，陽性組及安溪肉桂提取物組在致炎后1 h開始對(duì)大鼠足趾腫脹有顯著的抑制作用（p＜0.05）。安溪肉桂提取物高劑量組（2 g/kg）于致炎后1 h開始即可顯著減輕大鼠足趾腫脹度，抗炎作用一直持續(xù)至致炎后6 h（p＜0.05）。安溪肉桂提取物低劑量組（0.5 g/kg）及中劑量組（1 g/kg）在致炎后2 h內(nèi)有明顯減輕足趾腫脹度的作用。由上述結(jié)果可以看出安溪肉桂提取物對(duì)蛋清所致的大鼠足趾腫脹有明顯的抑制作用。

2.2.2 大鼠棉球肉芽腫試驗(yàn)結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，陽性組及安溪肉桂提取物組的肉芽腫重量有顯著性的下降（p＜0.05）。安溪肉桂提取物3個(gè)劑量均可極顯著地減輕大鼠肉芽腫重量（p＜0.01）。由上述結(jié)果可以看出安溪肉桂提取物對(duì)棉球所致的大鼠肉芽腫有明顯抑制作用。

表6 大鼠足趾腫脹試驗(yàn)結(jié)果（±SD）Table 6 Results of paw edema experiment in rats(±SD)

表6 大鼠足趾腫脹試驗(yàn)結(jié)果（±SD）Table 6 Results of paw edema experiment in rats(±SD)

注：與陰性對(duì)照組比較，* 表示差異顯著（p＜0.05），** 表示極顯著差異（p＜0.01），下同。Note:Compared with the negative control group，*indicated significance at p＜0.05，**indicated significance at p＜0.01，the same as followed.

致炎后6 h 6 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n s陰性對(duì)照組 8（1 6） - 0.6 6±0.1 9 0.6 1±0.1 7 0.4 9±0.2 0 0.4 0±0.1 7陽性對(duì)照組 8（1 6） 0.6 3 0.4 6±0.2 4** 0.4 6±0.1 6** 0.4 5±0.1 4 0.3 2±0.1 7組別T r e a t m e n t s動(dòng)物數(shù)（足趾數(shù)）N u m b e r o f a n i m a l(n u m b e r o f t o e s)劑量（g/k g）D o s a g e致炎后不同時(shí)間足趾腫脹度（m L）R a t e o f r a t p a w e d e m a致炎后1 h 1 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n致炎后2 h 2 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n致炎后4 h 4 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n安溪肉桂提取物8（1 6） 0.5 0.5 2±0.1 7* 0.4 8±0.1 4* 0.4 6±0.1 6 0.3 4±0.1 6 8（1 6） 1 0.5 0±0.2 2* 0.4 0±0.1 5** 0.3 8±0.1 9 0.2 6±0.1 6*8（1 6） 2 0.4 7±0.1 6** 0.4 6±0.1 6* 0.3 8±0.1 6* 0.2 7±0.1 0*

表7 大鼠棉球植入試驗(yàn)結(jié)果（±SD）Table 7 Results of cotton ball implantation experiment in rats(±SD)

表7 大鼠棉球植入試驗(yàn)結(jié)果（±SD）Table 7 Results of cotton ball implantation experiment in rats(±SD)

肉芽腫重量（m g）N e t w e i g h t o f r a t g r a n u l o m a陰性對(duì)照組 8（1 6） - 1 3 8.1 8±6 3.2 4陽性對(duì)照組 8（1 6） 0.6 3 9 6.1 5±4 9.5 9*組別T r e a t m e n t動(dòng)物數(shù)（肉芽腫數(shù)）N u m b e r o f a n i m a l劑量（g/k g）D o s a g e安溪肉桂提取物8（1 6） 0.5 9 0.3 2±3 1.7 1**8（1 6） 1 8 5.8 4±3 3.4 5**8（1 6） 2 7 0.0 5±3 3.1 7**

2.2.3 對(duì)血清炎癥因子的影響

與陰性對(duì)照組比較，陽性組及安溪肉桂提取物高劑量組（2 g/kg）的三種炎癥因子均有顯著性的下降（p＜0.05）。安溪肉桂提取物低劑量（0.5 g/kg）和中劑量（1 g/kg）未見此效果。由上述結(jié)果可以看出安溪肉桂提取物（2 g/kg）可顯著性地降低大鼠血清中的 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量（p＜0.05）。

表8 對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響Table 8 Effect on serum inflammatory factors in rats

3 討論

王潤明[1]對(duì)0～7歲兒童咽部感染病原菌的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了肺炎鏈球菌、普通變形桿菌、大腸埃希氏菌等。同時(shí)，在對(duì)清熱顆粒、清熱利咽茶和對(duì)急慢性咽炎藥物的體外抑菌性研究中，均使用到了乙型溶血型鏈球菌、肺炎鏈球菌和普通變形桿菌[2-4]。因此，研究選用了乙型溶血型鏈球菌、肺炎鏈球菌和普通變形桿菌這三種菌作為受試菌種。在預(yù)試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，使用一般沖泡的方法進(jìn)行提取獲得的提取液并沒有明顯的抑菌效果，因此隨后使用了有機(jī)試劑進(jìn)行提取。較多研究發(fā)現(xiàn)，黃酮對(duì)普通變形桿菌[5-6]、肺炎鏈球菌[7-8]和乙型溶血性鏈球菌[9-10]都有良好的抑菌作用，且黃酮對(duì)乙型溶血性鏈球菌的抑菌性要優(yōu)于肺炎鏈球菌，盡管所測肉桂中茶多酚含量不高，但其良好的抑菌效果可能與其兒茶素組成及黃酮類物質(zhì)占比有關(guān)，具體結(jié)果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

體內(nèi)外試驗(yàn)說明安溪肉桂提取物具有較明顯的抗炎作用，具有干預(yù)急性炎癥（足趾腫脹）和慢性炎癥（肉芽腫形成）的作用，并能減少炎癥因子的產(chǎn)生。根據(jù)保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）可得出，動(dòng)物試驗(yàn)證明安溪肉桂茶具有一定的清咽保健功效，但還需要后續(xù)人體試食實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。