黃業(yè)偉 ， 朱強(qiáng)強(qiáng) ， 向澤敏 *， 張冬英 *

（1.普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

普洱茶是云南的特有名茶，是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)采用特定加工工藝制成的，具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉[1]。普洱熟茶的特殊加工工藝決定了其獨(dú)特的品質(zhì)特征和健康功效。近年來(lái)，隨著普洱熟茶保健功效被逐漸揭示，越發(fā)引起人們對(duì)普洱熟茶功能成分及其作用機(jī)理的關(guān)注。但由于普洱熟茶加工過(guò)程中特殊的濕熱作用和微生物作用，導(dǎo)致其成分分析和分離一直是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，這也在一定程度上阻礙了普洱熟茶保健功效機(jī)理的闡明。檢測(cè)分析普洱熟茶成分的方法很多，前人也已做了很多研究工作。文章通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析，總結(jié)普洱熟茶成分分析和分離方面的研究成果和現(xiàn)存問(wèn)題并尋求可能的解決辦法。

1 普洱熟茶主要成分的檢測(cè)現(xiàn)狀

普洱熟茶發(fā)酵過(guò)程中，其原料化學(xué)成分發(fā)生了很大程度的轉(zhuǎn)化，如多糖、蛋白質(zhì)等的降解和多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化等。因此，普洱熟茶發(fā)酵階段色澤的量化分析，即多酚氧化程度可作為普洱熟茶品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[2]。普洱熟茶主要成分的分析包括茶多酚、兒茶素、咖啡堿、沒(méi)食子酸、茶多糖、茶褐素、茶紅素、茶黃素、水溶性蛋白質(zhì)、總黃酮和游離氨基酸等。其中單體成分的測(cè)定主要采用高效液相色譜法，檢測(cè)方法和結(jié)果相對(duì)可靠。其它主要成分的分析方法包括：蒽酮比色法和硫酸苯酚法測(cè)定茶多糖含量；香莢蘭素-濃鹽酸比色法測(cè)定總兒茶素；Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；比色系統(tǒng)分析法測(cè)定茶黃素、茶紅素和茶褐素的含量；比色法測(cè)定茶多酚的含量；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 體系分光光度法和三氯化鋁比色法測(cè)定總黃酮含量；茚三酮比色法、甲醛滴定法和氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸含量等?，F(xiàn)將普洱熟茶中主要成分的檢測(cè)方法和測(cè)定結(jié)果列于表1。

表1 普洱熟茶中主要成分的檢測(cè)Table 1 Determination of the main components in fermented Pu-erh tea

如表1所示，除HPLC法之外，普洱熟茶主要成分的檢測(cè)基本都是應(yīng)用比色法原理。針對(duì)普洱熟茶中的主要成分，用不同的比色方法檢測(cè)甚至同一方法測(cè)定出的結(jié)果差異非常顯著。不同的文獻(xiàn)中應(yīng)用系統(tǒng)比色法檢測(cè)普洱熟茶中茶褐素結(jié)果顯示，含量在1.66%～31.33%之間，前后相差近19倍；茶紅素和茶黃素的檢測(cè)結(jié)果相差更是達(dá)到了60倍以上；茶多酚的檢測(cè)結(jié)果差異亦達(dá)20倍；總兒茶素、游離氨基酸、茶多糖和總黃酮檢測(cè)結(jié)果最大相差百倍以上。

2 影響普洱熟茶主要成分檢測(cè)的問(wèn)題分析

雖然檢測(cè)樣品的來(lái)源不同、提取方法的不同等諸多因素均會(huì)影響普洱熟茶主要成分檢測(cè)的結(jié)果，但普洱熟茶中的茶褐素可能是導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果巨大差異的主要原因。研究表明，普洱熟茶提取物中含有氧化型茶多酚 （即茶褐素），可與多糖、蛋白、咖啡堿等結(jié)合形成復(fù)合物，且?guī)в休^深的紅褐色[33-34]，這可能會(huì)對(duì)比色法原理應(yīng)用于普洱熟茶成分檢測(cè)帶來(lái)嚴(yán)重干擾。

已有研究表明，若先對(duì)普洱熟茶用水提?。ɑ?qū)⑵斩觳璺壑苯尤苡谒龠M(jìn)行80%醇沉，然后用0.5 mol/L的鹽酸溶液在40℃下水解30 min，用聚酰胺層析柱分離洗脫，最后用苯酚-硫酸法測(cè)定茶多糖的含量[32]，可有效去除普洱熟茶中茶色素等物質(zhì)的干擾，較準(zhǔn)確測(cè)定出水溶性茶多糖的含量約為6%，而直接用苯酚-硫酸法測(cè)出多糖的含量為18%左右。另有研究表明，普洱熟茶的化學(xué)成分十分復(fù)雜，熟茶樣品在540 nm處沒(méi)有明顯的吸收峰，用酒石酸亞鐵比色法可能不適合檢測(cè)普洱熟茶樣品中茶多酚的含量[35]。因此，運(yùn)用比色法原理測(cè)定普洱熟茶中主要成分的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步考證[36]。

譚超等[37]研究表明，茶褐素的形成機(jī)理是兒茶素氧化產(chǎn)物與多糖、蛋白質(zhì)、核酸等非酚性物質(zhì)參與合成的非透析性高分子聚合物，其組成十分復(fù)雜，它是一類(lèi)性質(zhì)類(lèi)似于紅茶茶褐素的高聚合物，能溶于水而不溶于乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等有機(jī)溶劑，主要由含多苯環(huán)的褐色色素、多糖殘基、蛋白殘基組成，主要的功能性基團(tuán)為羧基、羥基、氨基以及甲基等，具有酚類(lèi)物質(zhì)特性。因此，茶褐素的這些特性，不僅嚴(yán)重干擾普洱熟茶中主要成分的含量測(cè)定，也會(huì)對(duì)其組分分離帶來(lái)不利影響。

3 普洱熟茶主要成分的分離研究進(jìn)展

由于咖啡堿和沒(méi)食子酸等小分子物質(zhì)的含量和結(jié)構(gòu)及其生物活性相對(duì)清楚，其提取和分離方法亦相對(duì)確定和成熟。因此，對(duì)普洱熟茶主要成分的分離、純化研究主要集中于茶褐素和茶多糖這兩類(lèi)區(qū)別于其他茶類(lèi)的特征性物質(zhì)，文章亦就這兩類(lèi)物質(zhì)的分離、純化研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

3.1 普洱熟茶茶褐素的提取和分離

李連喜[35]研究表明，茶褐素屬酚類(lèi)物質(zhì)，含有羥基、烷基、羧基及苯環(huán)類(lèi)物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量較大，多次柱分離后，茶褐素組分的重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）為 2878，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量（Mn）為 2120，多分散性指數(shù)為1.36。紅外光譜和理化性質(zhì)分析表明，茶褐素主要是由酚和羧酸類(lèi)物質(zhì)構(gòu)成，并含有蛋白質(zhì)、糖等化合物。茶褐素中起主要絡(luò)合作用的羧基和酚羥基等主要酸性基團(tuán)還可與金屬發(fā)生絡(luò)合作用[38]。茶褐素形成機(jī)制可表述為微生物分泌的酶的酶促反應(yīng)及其反應(yīng)產(chǎn)物與成分間的偶聯(lián)氧化、聚合[39]。也有研究顯示茶褐素為多羥基物質(zhì)，其中含有烷基、苯環(huán)、羧基、多糖殘基、蛋白殘基等基團(tuán)[40]。

浸提條件對(duì)茶褐素提取率有較大影響，一般情況下，普洱熟茶茶褐素的提取流程如下：普洱熟茶→粉碎→無(wú)水乙醇浸泡→過(guò)濾→茶渣→熱蒸餾水浸泡→離心抽濾→合并濾液→減壓濃縮→二氯甲烷萃取2次→乙酸乙酯萃取3次→正丁醇萃取4次→水相減壓濃縮→加無(wú)水乙醇→抽濾→收集沉淀→干燥→茶褐素[3，36]。水浴綜合浸提普洱熟茶多酚和茶褐素的最佳工藝參數(shù)為：溫度100℃，時(shí)間60 min，液料比為1∶25，此時(shí)茶多酚含量可達(dá)到9.04%，茶褐素提取率可達(dá)到93.15%。對(duì)茶褐素提取物進(jìn)行成分分析，結(jié)果如表2所示。

表2 普洱熟茶茶褐素提取物的成分分析Table 2 The component analysis of theabrownin extracted from Pu-erh tea

由表2可知，所謂的茶褐素提取物，檢測(cè)到的茶褐素僅占35.30%～44.83%，其中還包含茶黃素、茶紅素、茶多糖、蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)[41]。除浸提法以外，王天祿等[42]也嘗試通過(guò)比較不同樹(shù)脂對(duì)茶褐素的吸附與解吸能力，選擇AB-8大孔樹(shù)脂、DEAE-52陰離子交換樹(shù)脂等對(duì)普洱茶茶褐素進(jìn)行分離，得到的不同組分的茶褐素中仍然含有多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。另有張欽等[43]以“紫娟”普洱熟茶為原料，分離制備茶褐素，采用膜技術(shù)對(duì)茶褐素分級(jí)，結(jié)果表明，“紫娟”普洱茶茶褐素屬苯多酚類(lèi)物質(zhì)，并含有酚性色素、多糖、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)及生物堿等。楊新河等[44]采用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析對(duì)普洱熟茶水溶性色素進(jìn)行分級(jí)研究，研究結(jié)果亦再一次證明了普洱熟茶水溶性茶色素組成與性質(zhì)的復(fù)雜性。

由此可見(jiàn)，普洱熟茶中的茶褐素與紅茶中的色素類(lèi)物質(zhì)可能有很大區(qū)別，主要體現(xiàn)在前者是在長(zhǎng)期渥堆發(fā)酵、微生物充分參與的環(huán)境中形成的，并在此過(guò)程中與多糖、蛋白、脂質(zhì)、生物堿等物質(zhì)結(jié)合成為高聚物[33-34]，而紅茶中的色素形成過(guò)程是在紅茶短期“發(fā)酵”（實(shí)為有氧氧化，微生物作用較少）的相對(duì)簡(jiǎn)單環(huán)境中進(jìn)行，與其它成分的相互作用亦相對(duì)簡(jiǎn)單。普洱熟茶中茶褐素與其它成分的相互作用也導(dǎo)致了其分離組分的具體成分一直未能完全明確，乙酸乙酯萃取組分、正丁醇萃取組分不清楚[44-45]，研究結(jié)果僅停留在對(duì)其特征的推測(cè)性描述[46]。

3.2 普洱熟茶茶多糖的提取和分離

普洱熟茶多糖的分離純化包括水提、醇沉、脫蛋白、脫色等，提取物含有中性糖蛋白、酸性糖蛋白等[47]。一般的普洱熟茶多糖提取工藝流程如下：茶樣→85℃熱水浸泡→茶湯→乙醇浸泡→茶渣→熱水溶解→濾液→濃縮液→氯仿萃取→水層→乙酸乙酯萃取→水層→正丁醇萃取→水層→無(wú)水乙醇→沉淀→熱水溶解→溶液→濃縮、40%乙醇溶解→茶多糖。

有研究認(rèn)為，茶多糖是一類(lèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合的非還原性雜多糖[6，48]，含有糖醛酸，而且還含有多酚氧化產(chǎn)物，說(shuō)明多糖未能與多酚氧化產(chǎn)物分離[49]。普洱熟茶中多糖提取率可達(dá)12%[50]，也有研究表明多糖提取僅為1.7731%[51-52]，而且水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯仿等不能將氧化型茶多酚、可溶性糖和咖啡堿等物質(zhì)較好分離[53]。茶原料、發(fā)酵的微生物種類(lèi)以及發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)普洱熟茶中茶多糖的分子量都有影響。

關(guān)媛[54]以及楊新河等[55]研究了樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果及DEAE-52纖維素離子交換樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖的分離效果。結(jié)果表明，D101樹(shù)脂適合于對(duì)普洱茶多糖同時(shí)脫色和蛋白質(zhì)去除，但普洱茶多糖的脫色率只能達(dá)到82.33%，蛋白質(zhì)去除率僅為70.89%。總之，氧化型茶多酚也具有醇沉性，因此用醇沉法提取普洱熟茶中的多糖并不可取，且氧化型茶多酚與多糖之間的復(fù)雜相互作用導(dǎo)致了普洱熟茶多糖的分離研究至今尚未明確[56]。

4 展望

綜上關(guān)于普洱熟茶成分分析與分離的研究表明：不同研究人員或者方法所得的普洱熟茶成分含量測(cè)定結(jié)果相差較大，這可能與其在加工過(guò)程中長(zhǎng)期的濕熱變化和微生物作用等因素有關(guān)，因?yàn)檫@些因素導(dǎo)致其中的多酚類(lèi)物質(zhì)氧化、聚合形成紅褐色的色素類(lèi)物質(zhì)，并與其它組分相互結(jié)合，從而對(duì)很多基于比色原理的檢測(cè)帶來(lái)較大干擾。此外，普洱熟茶中茶褐素與其它組分的相互作用亦導(dǎo)致普洱熟茶主要成分（茶褐素和茶多糖等）的分離難以實(shí)現(xiàn)?？傊?，常規(guī)的茶葉成分分析和分離方法可能并不適用于普洱熟茶。

研究表明，普洱熟茶加工過(guò)程中的主要化學(xué)變化包括：（1）在微生物的作用下，茶葉中的淀粉、纖維素、多聚糖、果膠等多糖以及蛋白質(zhì)等大分子被部分降解；（2）多酚類(lèi)物質(zhì)因茶葉細(xì)胞遭到破壞而暴露，并在濕熱作用和微生物作用等條件下發(fā)生氧化聚合反應(yīng)。氧化型茶多酚因其多聚酚羥基等特殊結(jié)構(gòu)而能與咖啡堿、糖類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等相互作用，并以非共價(jià)鍵的形式形成大分子復(fù)合物，這也正是用常規(guī)方法難以對(duì)普洱茶主要成分進(jìn)行分析和分離的主要原因。

鑒于普洱熟茶原料（茶鮮葉或曬青毛茶）的成分清楚，且其發(fā)酵過(guò)程（包括發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)環(huán)境、微生物種類(lèi)、酶的種類(lèi)、濕熱作用情況等）已基本明確，不妨嘗試以已知的原料成分和發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)變化為依據(jù)，進(jìn)而對(duì)普洱熟茶成分及其含量進(jìn)行判定，這可能更易于闡明普洱熟茶的成分組成、保健功效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理。