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        普洱熟茶主要成分檢測和分離的研究進(jìn)展與展望

        2019-04-17 07:35:06黃業(yè)偉朱強(qiáng)強(qiáng)向澤敏張冬英
        中國茶葉加工 2019年1期
        關(guān)鍵詞:比色法普洱茶多酚

        黃業(yè)偉 , 朱強(qiáng)強(qiáng) , 向澤敏 *, 張冬英 *

        (1.普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,云南昆明 650201;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

        普洱茶是云南的特有名茶,是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料,并在地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)采用特定加工工藝制成的,具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉[1]。普洱熟茶的特殊加工工藝決定了其獨(dú)特的品質(zhì)特征和健康功效。近年來,隨著普洱熟茶保健功效被逐漸揭示,越發(fā)引起人們對普洱熟茶功能成分及其作用機(jī)理的關(guān)注。但由于普洱熟茶加工過程中特殊的濕熱作用和微生物作用,導(dǎo)致其成分分析和分離一直是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn),這也在一定程度上阻礙了普洱熟茶保健功效機(jī)理的闡明。檢測分析普洱熟茶成分的方法很多,前人也已做了很多研究工作。文章通過對現(xiàn)有的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析,總結(jié)普洱熟茶成分分析和分離方面的研究成果和現(xiàn)存問題并尋求可能的解決辦法。

        1 普洱熟茶主要成分的檢測現(xiàn)狀

        普洱熟茶發(fā)酵過程中,其原料化學(xué)成分發(fā)生了很大程度的轉(zhuǎn)化,如多糖、蛋白質(zhì)等的降解和多酚類物質(zhì)的氧化等。因此,普洱熟茶發(fā)酵階段色澤的量化分析,即多酚氧化程度可作為普洱熟茶品質(zhì)評價的重要指標(biāo)[2]。普洱熟茶主要成分的分析包括茶多酚、兒茶素、咖啡堿、沒食子酸、茶多糖、茶褐素、茶紅素、茶黃素、水溶性蛋白質(zhì)、總黃酮和游離氨基酸等。其中單體成分的測定主要采用高效液相色譜法,檢測方法和結(jié)果相對可靠。其它主要成分的分析方法包括:蒽酮比色法和硫酸苯酚法測定茶多糖含量;香莢蘭素-濃鹽酸比色法測定總兒茶素;Bradford法測定蛋白質(zhì)含量;比色系統(tǒng)分析法測定茶黃素、茶紅素和茶褐素的含量;比色法測定茶多酚的含量;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系分光光度法和三氯化鋁比色法測定總黃酮含量;茚三酮比色法、甲醛滴定法和氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量等?,F(xiàn)將普洱熟茶中主要成分的檢測方法和測定結(jié)果列于表1。

        表1 普洱熟茶中主要成分的檢測Table 1 Determination of the main components in fermented Pu-erh tea

        如表1所示,除HPLC法之外,普洱熟茶主要成分的檢測基本都是應(yīng)用比色法原理。針對普洱熟茶中的主要成分,用不同的比色方法檢測甚至同一方法測定出的結(jié)果差異非常顯著。不同的文獻(xiàn)中應(yīng)用系統(tǒng)比色法檢測普洱熟茶中茶褐素結(jié)果顯示,含量在1.66%~31.33%之間,前后相差近19倍;茶紅素和茶黃素的檢測結(jié)果相差更是達(dá)到了60倍以上;茶多酚的檢測結(jié)果差異亦達(dá)20倍;總兒茶素、游離氨基酸、茶多糖和總黃酮檢測結(jié)果最大相差百倍以上。

        2 影響普洱熟茶主要成分檢測的問題分析

        雖然檢測樣品的來源不同、提取方法的不同等諸多因素均會影響普洱熟茶主要成分檢測的結(jié)果,但普洱熟茶中的茶褐素可能是導(dǎo)致檢測結(jié)果巨大差異的主要原因。研究表明,普洱熟茶提取物中含有氧化型茶多酚 (即茶褐素),可與多糖、蛋白、咖啡堿等結(jié)合形成復(fù)合物,且?guī)в休^深的紅褐色[33-34],這可能會對比色法原理應(yīng)用于普洱熟茶成分檢測帶來嚴(yán)重干擾。

        已有研究表明,若先對普洱熟茶用水提取(或?qū)⑵斩觳璺壑苯尤苡谒?,再進(jìn)行80%醇沉,然后用0.5 mol/L的鹽酸溶液在40℃下水解30 min,用聚酰胺層析柱分離洗脫,最后用苯酚-硫酸法測定茶多糖的含量[32],可有效去除普洱熟茶中茶色素等物質(zhì)的干擾,較準(zhǔn)確測定出水溶性茶多糖的含量約為6%,而直接用苯酚-硫酸法測出多糖的含量為18%左右。另有研究表明,普洱熟茶的化學(xué)成分十分復(fù)雜,熟茶樣品在540 nm處沒有明顯的吸收峰,用酒石酸亞鐵比色法可能不適合檢測普洱熟茶樣品中茶多酚的含量[35]。因此,運(yùn)用比色法原理測定普洱熟茶中主要成分的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步考證[36]。

        譚超等[37]研究表明,茶褐素的形成機(jī)理是兒茶素氧化產(chǎn)物與多糖、蛋白質(zhì)、核酸等非酚性物質(zhì)參與合成的非透析性高分子聚合物,其組成十分復(fù)雜,它是一類性質(zhì)類似于紅茶茶褐素的高聚合物,能溶于水而不溶于乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等有機(jī)溶劑,主要由含多苯環(huán)的褐色色素、多糖殘基、蛋白殘基組成,主要的功能性基團(tuán)為羧基、羥基、氨基以及甲基等,具有酚類物質(zhì)特性。因此,茶褐素的這些特性,不僅嚴(yán)重干擾普洱熟茶中主要成分的含量測定,也會對其組分分離帶來不利影響。

        3 普洱熟茶主要成分的分離研究進(jìn)展

        由于咖啡堿和沒食子酸等小分子物質(zhì)的含量和結(jié)構(gòu)及其生物活性相對清楚,其提取和分離方法亦相對確定和成熟。因此,對普洱熟茶主要成分的分離、純化研究主要集中于茶褐素和茶多糖這兩類區(qū)別于其他茶類的特征性物質(zhì),文章亦就這兩類物質(zhì)的分離、純化研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

        3.1 普洱熟茶茶褐素的提取和分離

        李連喜[35]研究表明,茶褐素屬酚類物質(zhì),含有羥基、烷基、羧基及苯環(huán)類物質(zhì),相對分子質(zhì)量較大,多次柱分離后,茶褐素組分的重均相對分子質(zhì)量(Mw)為 2878,數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)為 2120,多分散性指數(shù)為1.36。紅外光譜和理化性質(zhì)分析表明,茶褐素主要是由酚和羧酸類物質(zhì)構(gòu)成,并含有蛋白質(zhì)、糖等化合物。茶褐素中起主要絡(luò)合作用的羧基和酚羥基等主要酸性基團(tuán)還可與金屬發(fā)生絡(luò)合作用[38]。茶褐素形成機(jī)制可表述為微生物分泌的酶的酶促反應(yīng)及其反應(yīng)產(chǎn)物與成分間的偶聯(lián)氧化、聚合[39]。也有研究顯示茶褐素為多羥基物質(zhì),其中含有烷基、苯環(huán)、羧基、多糖殘基、蛋白殘基等基團(tuán)[40]。

        浸提條件對茶褐素提取率有較大影響,一般情況下,普洱熟茶茶褐素的提取流程如下:普洱熟茶→粉碎→無水乙醇浸泡→過濾→茶渣→熱蒸餾水浸泡→離心抽濾→合并濾液→減壓濃縮→二氯甲烷萃取2次→乙酸乙酯萃取3次→正丁醇萃取4次→水相減壓濃縮→加無水乙醇→抽濾→收集沉淀→干燥→茶褐素[3,36]。水浴綜合浸提普洱熟茶多酚和茶褐素的最佳工藝參數(shù)為:溫度100℃,時間60 min,液料比為1∶25,此時茶多酚含量可達(dá)到9.04%,茶褐素提取率可達(dá)到93.15%。對茶褐素提取物進(jìn)行成分分析,結(jié)果如表2所示。

        表2 普洱熟茶茶褐素提取物的成分分析Table 2 The component analysis of theabrownin extracted from Pu-erh tea

        由表2可知,所謂的茶褐素提取物,檢測到的茶褐素僅占35.30%~44.83%,其中還包含茶黃素、茶紅素、茶多糖、蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)[41]。除浸提法以外,王天祿等[42]也嘗試通過比較不同樹脂對茶褐素的吸附與解吸能力,選擇AB-8大孔樹脂、DEAE-52陰離子交換樹脂等對普洱茶茶褐素進(jìn)行分離,得到的不同組分的茶褐素中仍然含有多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。另有張欽等[43]以“紫娟”普洱熟茶為原料,分離制備茶褐素,采用膜技術(shù)對茶褐素分級,結(jié)果表明,“紫娟”普洱茶茶褐素屬苯多酚類物質(zhì),并含有酚性色素、多糖、蛋白質(zhì)、脂類及生物堿等。楊新河等[44]采用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析對普洱熟茶水溶性色素進(jìn)行分級研究,研究結(jié)果亦再一次證明了普洱熟茶水溶性茶色素組成與性質(zhì)的復(fù)雜性。

        由此可見,普洱熟茶中的茶褐素與紅茶中的色素類物質(zhì)可能有很大區(qū)別,主要體現(xiàn)在前者是在長期渥堆發(fā)酵、微生物充分參與的環(huán)境中形成的,并在此過程中與多糖、蛋白、脂質(zhì)、生物堿等物質(zhì)結(jié)合成為高聚物[33-34],而紅茶中的色素形成過程是在紅茶短期“發(fā)酵”(實(shí)為有氧氧化,微生物作用較少)的相對簡單環(huán)境中進(jìn)行,與其它成分的相互作用亦相對簡單。普洱熟茶中茶褐素與其它成分的相互作用也導(dǎo)致了其分離組分的具體成分一直未能完全明確,乙酸乙酯萃取組分、正丁醇萃取組分不清楚[44-45],研究結(jié)果僅停留在對其特征的推測性描述[46]。

        3.2 普洱熟茶茶多糖的提取和分離

        普洱熟茶多糖的分離純化包括水提、醇沉、脫蛋白、脫色等,提取物含有中性糖蛋白、酸性糖蛋白等[47]。一般的普洱熟茶多糖提取工藝流程如下:茶樣→85℃熱水浸泡→茶湯→乙醇浸泡→茶渣→熱水溶解→濾液→濃縮液→氯仿萃取→水層→乙酸乙酯萃取→水層→正丁醇萃取→水層→無水乙醇→沉淀→熱水溶解→溶液→濃縮、40%乙醇溶解→茶多糖。

        有研究認(rèn)為,茶多糖是一類與蛋白質(zhì)結(jié)合的非還原性雜多糖[6,48],含有糖醛酸,而且還含有多酚氧化產(chǎn)物,說明多糖未能與多酚氧化產(chǎn)物分離[49]。普洱熟茶中多糖提取率可達(dá)12%[50],也有研究表明多糖提取僅為1.7731%[51-52],而且水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯仿等不能將氧化型茶多酚、可溶性糖和咖啡堿等物質(zhì)較好分離[53]。茶原料、發(fā)酵的微生物種類以及發(fā)酵時間等因素對普洱熟茶中茶多糖的分子量都有影響。

        關(guān)媛[54]以及楊新河等[55]研究了樹脂對普洱茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果及DEAE-52纖維素離子交換樹脂對普洱茶多糖的分離效果。結(jié)果表明,D101樹脂適合于對普洱茶多糖同時脫色和蛋白質(zhì)去除,但普洱茶多糖的脫色率只能達(dá)到82.33%,蛋白質(zhì)去除率僅為70.89%??傊?,氧化型茶多酚也具有醇沉性,因此用醇沉法提取普洱熟茶中的多糖并不可取,且氧化型茶多酚與多糖之間的復(fù)雜相互作用導(dǎo)致了普洱熟茶多糖的分離研究至今尚未明確[56]。

        4 展望

        綜上關(guān)于普洱熟茶成分分析與分離的研究表明:不同研究人員或者方法所得的普洱熟茶成分含量測定結(jié)果相差較大,這可能與其在加工過程中長期的濕熱變化和微生物作用等因素有關(guān),因?yàn)檫@些因素導(dǎo)致其中的多酚類物質(zhì)氧化、聚合形成紅褐色的色素類物質(zhì),并與其它組分相互結(jié)合,從而對很多基于比色原理的檢測帶來較大干擾。此外,普洱熟茶中茶褐素與其它組分的相互作用亦導(dǎo)致普洱熟茶主要成分(茶褐素和茶多糖等)的分離難以實(shí)現(xiàn)。總之,常規(guī)的茶葉成分分析和分離方法可能并不適用于普洱熟茶。

        研究表明,普洱熟茶加工過程中的主要化學(xué)變化包括:(1)在微生物的作用下,茶葉中的淀粉、纖維素、多聚糖、果膠等多糖以及蛋白質(zhì)等大分子被部分降解;(2)多酚類物質(zhì)因茶葉細(xì)胞遭到破壞而暴露,并在濕熱作用和微生物作用等條件下發(fā)生氧化聚合反應(yīng)。氧化型茶多酚因其多聚酚羥基等特殊結(jié)構(gòu)而能與咖啡堿、糖類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等相互作用,并以非共價鍵的形式形成大分子復(fù)合物,這也正是用常規(guī)方法難以對普洱茶主要成分進(jìn)行分析和分離的主要原因。

        鑒于普洱熟茶原料(茶鮮葉或曬青毛茶)的成分清楚,且其發(fā)酵過程(包括發(fā)酵過程中的化學(xué)環(huán)境、微生物種類、酶的種類、濕熱作用情況等)已基本明確,不妨嘗試以已知的原料成分和發(fā)酵過程中的化學(xué)變化為依據(jù),進(jìn)而對普洱熟茶成分及其含量進(jìn)行判定,這可能更易于闡明普洱熟茶的成分組成、保健功效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理。

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