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        普洱熟茶主要成分檢測和分離的研究進展與展望

        2019-04-17 07:35:06黃業(yè)偉朱強強向澤敏張冬英
        中國茶葉加工 2019年1期
        關鍵詞:比色法普洱茶多酚

        黃業(yè)偉 , 朱強強 , 向澤敏 *, 張冬英 *

        (1.普洱茶學教育部重點實驗室,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學理學院,云南昆明 650201;3.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,云南昆明 650201)

        普洱茶是云南的特有名茶,是以地理標志保護范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料,并在地理標志保護范圍內(nèi)采用特定加工工藝制成的,具有獨特品質(zhì)特征的茶葉[1]。普洱熟茶的特殊加工工藝決定了其獨特的品質(zhì)特征和健康功效。近年來,隨著普洱熟茶保健功效被逐漸揭示,越發(fā)引起人們對普洱熟茶功能成分及其作用機理的關注。但由于普洱熟茶加工過程中特殊的濕熱作用和微生物作用,導致其成分分析和分離一直是該領域的熱點和難點,這也在一定程度上阻礙了普洱熟茶保健功效機理的闡明。檢測分析普洱熟茶成分的方法很多,前人也已做了很多研究工作。文章通過對現(xiàn)有的文獻進行綜合分析,總結普洱熟茶成分分析和分離方面的研究成果和現(xiàn)存問題并尋求可能的解決辦法。

        1 普洱熟茶主要成分的檢測現(xiàn)狀

        普洱熟茶發(fā)酵過程中,其原料化學成分發(fā)生了很大程度的轉(zhuǎn)化,如多糖、蛋白質(zhì)等的降解和多酚類物質(zhì)的氧化等。因此,普洱熟茶發(fā)酵階段色澤的量化分析,即多酚氧化程度可作為普洱熟茶品質(zhì)評價的重要指標[2]。普洱熟茶主要成分的分析包括茶多酚、兒茶素、咖啡堿、沒食子酸、茶多糖、茶褐素、茶紅素、茶黃素、水溶性蛋白質(zhì)、總黃酮和游離氨基酸等。其中單體成分的測定主要采用高效液相色譜法,檢測方法和結果相對可靠。其它主要成分的分析方法包括:蒽酮比色法和硫酸苯酚法測定茶多糖含量;香莢蘭素-濃鹽酸比色法測定總兒茶素;Bradford法測定蛋白質(zhì)含量;比色系統(tǒng)分析法測定茶黃素、茶紅素和茶褐素的含量;比色法測定茶多酚的含量;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系分光光度法和三氯化鋁比色法測定總黃酮含量;茚三酮比色法、甲醛滴定法和氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量等。現(xiàn)將普洱熟茶中主要成分的檢測方法和測定結果列于表1。

        表1 普洱熟茶中主要成分的檢測Table 1 Determination of the main components in fermented Pu-erh tea

        如表1所示,除HPLC法之外,普洱熟茶主要成分的檢測基本都是應用比色法原理。針對普洱熟茶中的主要成分,用不同的比色方法檢測甚至同一方法測定出的結果差異非常顯著。不同的文獻中應用系統(tǒng)比色法檢測普洱熟茶中茶褐素結果顯示,含量在1.66%~31.33%之間,前后相差近19倍;茶紅素和茶黃素的檢測結果相差更是達到了60倍以上;茶多酚的檢測結果差異亦達20倍;總兒茶素、游離氨基酸、茶多糖和總黃酮檢測結果最大相差百倍以上。

        2 影響普洱熟茶主要成分檢測的問題分析

        雖然檢測樣品的來源不同、提取方法的不同等諸多因素均會影響普洱熟茶主要成分檢測的結果,但普洱熟茶中的茶褐素可能是導致檢測結果巨大差異的主要原因。研究表明,普洱熟茶提取物中含有氧化型茶多酚 (即茶褐素),可與多糖、蛋白、咖啡堿等結合形成復合物,且?guī)в休^深的紅褐色[33-34],這可能會對比色法原理應用于普洱熟茶成分檢測帶來嚴重干擾。

        已有研究表明,若先對普洱熟茶用水提?。ɑ?qū)⑵斩觳璺壑苯尤苡谒龠M行80%醇沉,然后用0.5 mol/L的鹽酸溶液在40℃下水解30 min,用聚酰胺層析柱分離洗脫,最后用苯酚-硫酸法測定茶多糖的含量[32],可有效去除普洱熟茶中茶色素等物質(zhì)的干擾,較準確測定出水溶性茶多糖的含量約為6%,而直接用苯酚-硫酸法測出多糖的含量為18%左右。另有研究表明,普洱熟茶的化學成分十分復雜,熟茶樣品在540 nm處沒有明顯的吸收峰,用酒石酸亞鐵比色法可能不適合檢測普洱熟茶樣品中茶多酚的含量[35]。因此,運用比色法原理測定普洱熟茶中主要成分的準確性有待進一步考證[36]。

        譚超等[37]研究表明,茶褐素的形成機理是兒茶素氧化產(chǎn)物與多糖、蛋白質(zhì)、核酸等非酚性物質(zhì)參與合成的非透析性高分子聚合物,其組成十分復雜,它是一類性質(zhì)類似于紅茶茶褐素的高聚合物,能溶于水而不溶于乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等有機溶劑,主要由含多苯環(huán)的褐色色素、多糖殘基、蛋白殘基組成,主要的功能性基團為羧基、羥基、氨基以及甲基等,具有酚類物質(zhì)特性。因此,茶褐素的這些特性,不僅嚴重干擾普洱熟茶中主要成分的含量測定,也會對其組分分離帶來不利影響。

        3 普洱熟茶主要成分的分離研究進展

        由于咖啡堿和沒食子酸等小分子物質(zhì)的含量和結構及其生物活性相對清楚,其提取和分離方法亦相對確定和成熟。因此,對普洱熟茶主要成分的分離、純化研究主要集中于茶褐素和茶多糖這兩類區(qū)別于其他茶類的特征性物質(zhì),文章亦就這兩類物質(zhì)的分離、純化研究進展進行綜述。

        3.1 普洱熟茶茶褐素的提取和分離

        李連喜[35]研究表明,茶褐素屬酚類物質(zhì),含有羥基、烷基、羧基及苯環(huán)類物質(zhì),相對分子質(zhì)量較大,多次柱分離后,茶褐素組分的重均相對分子質(zhì)量(Mw)為 2878,數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)為 2120,多分散性指數(shù)為1.36。紅外光譜和理化性質(zhì)分析表明,茶褐素主要是由酚和羧酸類物質(zhì)構成,并含有蛋白質(zhì)、糖等化合物。茶褐素中起主要絡合作用的羧基和酚羥基等主要酸性基團還可與金屬發(fā)生絡合作用[38]。茶褐素形成機制可表述為微生物分泌的酶的酶促反應及其反應產(chǎn)物與成分間的偶聯(lián)氧化、聚合[39]。也有研究顯示茶褐素為多羥基物質(zhì),其中含有烷基、苯環(huán)、羧基、多糖殘基、蛋白殘基等基團[40]。

        浸提條件對茶褐素提取率有較大影響,一般情況下,普洱熟茶茶褐素的提取流程如下:普洱熟茶→粉碎→無水乙醇浸泡→過濾→茶渣→熱蒸餾水浸泡→離心抽濾→合并濾液→減壓濃縮→二氯甲烷萃取2次→乙酸乙酯萃取3次→正丁醇萃取4次→水相減壓濃縮→加無水乙醇→抽濾→收集沉淀→干燥→茶褐素[3,36]。水浴綜合浸提普洱熟茶多酚和茶褐素的最佳工藝參數(shù)為:溫度100℃,時間60 min,液料比為1∶25,此時茶多酚含量可達到9.04%,茶褐素提取率可達到93.15%。對茶褐素提取物進行成分分析,結果如表2所示。

        表2 普洱熟茶茶褐素提取物的成分分析Table 2 The component analysis of theabrownin extracted from Pu-erh tea

        由表2可知,所謂的茶褐素提取物,檢測到的茶褐素僅占35.30%~44.83%,其中還包含茶黃素、茶紅素、茶多糖、蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)[41]。除浸提法以外,王天祿等[42]也嘗試通過比較不同樹脂對茶褐素的吸附與解吸能力,選擇AB-8大孔樹脂、DEAE-52陰離子交換樹脂等對普洱茶茶褐素進行分離,得到的不同組分的茶褐素中仍然含有多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。另有張欽等[43]以“紫娟”普洱熟茶為原料,分離制備茶褐素,采用膜技術對茶褐素分級,結果表明,“紫娟”普洱茶茶褐素屬苯多酚類物質(zhì),并含有酚性色素、多糖、蛋白質(zhì)、脂類及生物堿等。楊新河等[44]采用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析對普洱熟茶水溶性色素進行分級研究,研究結果亦再一次證明了普洱熟茶水溶性茶色素組成與性質(zhì)的復雜性。

        由此可見,普洱熟茶中的茶褐素與紅茶中的色素類物質(zhì)可能有很大區(qū)別,主要體現(xiàn)在前者是在長期渥堆發(fā)酵、微生物充分參與的環(huán)境中形成的,并在此過程中與多糖、蛋白、脂質(zhì)、生物堿等物質(zhì)結合成為高聚物[33-34],而紅茶中的色素形成過程是在紅茶短期“發(fā)酵”(實為有氧氧化,微生物作用較少)的相對簡單環(huán)境中進行,與其它成分的相互作用亦相對簡單。普洱熟茶中茶褐素與其它成分的相互作用也導致了其分離組分的具體成分一直未能完全明確,乙酸乙酯萃取組分、正丁醇萃取組分不清楚[44-45],研究結果僅停留在對其特征的推測性描述[46]。

        3.2 普洱熟茶茶多糖的提取和分離

        普洱熟茶多糖的分離純化包括水提、醇沉、脫蛋白、脫色等,提取物含有中性糖蛋白、酸性糖蛋白等[47]。一般的普洱熟茶多糖提取工藝流程如下:茶樣→85℃熱水浸泡→茶湯→乙醇浸泡→茶渣→熱水溶解→濾液→濃縮液→氯仿萃取→水層→乙酸乙酯萃取→水層→正丁醇萃取→水層→無水乙醇→沉淀→熱水溶解→溶液→濃縮、40%乙醇溶解→茶多糖。

        有研究認為,茶多糖是一類與蛋白質(zhì)結合的非還原性雜多糖[6,48],含有糖醛酸,而且還含有多酚氧化產(chǎn)物,說明多糖未能與多酚氧化產(chǎn)物分離[49]。普洱熟茶中多糖提取率可達12%[50],也有研究表明多糖提取僅為1.7731%[51-52],而且水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯仿等不能將氧化型茶多酚、可溶性糖和咖啡堿等物質(zhì)較好分離[53]。茶原料、發(fā)酵的微生物種類以及發(fā)酵時間等因素對普洱熟茶中茶多糖的分子量都有影響。

        關媛[54]以及楊新河等[55]研究了樹脂對普洱茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果及DEAE-52纖維素離子交換樹脂對普洱茶多糖的分離效果。結果表明,D101樹脂適合于對普洱茶多糖同時脫色和蛋白質(zhì)去除,但普洱茶多糖的脫色率只能達到82.33%,蛋白質(zhì)去除率僅為70.89%??傊趸筒瓒喾右簿哂写汲列裕虼擞么汲练ㄌ崛∑斩觳柚械亩嗵遣⒉豢扇?,且氧化型茶多酚與多糖之間的復雜相互作用導致了普洱熟茶多糖的分離研究至今尚未明確[56]。

        4 展望

        綜上關于普洱熟茶成分分析與分離的研究表明:不同研究人員或者方法所得的普洱熟茶成分含量測定結果相差較大,這可能與其在加工過程中長期的濕熱變化和微生物作用等因素有關,因為這些因素導致其中的多酚類物質(zhì)氧化、聚合形成紅褐色的色素類物質(zhì),并與其它組分相互結合,從而對很多基于比色原理的檢測帶來較大干擾。此外,普洱熟茶中茶褐素與其它組分的相互作用亦導致普洱熟茶主要成分(茶褐素和茶多糖等)的分離難以實現(xiàn)。總之,常規(guī)的茶葉成分分析和分離方法可能并不適用于普洱熟茶。

        研究表明,普洱熟茶加工過程中的主要化學變化包括:(1)在微生物的作用下,茶葉中的淀粉、纖維素、多聚糖、果膠等多糖以及蛋白質(zhì)等大分子被部分降解;(2)多酚類物質(zhì)因茶葉細胞遭到破壞而暴露,并在濕熱作用和微生物作用等條件下發(fā)生氧化聚合反應。氧化型茶多酚因其多聚酚羥基等特殊結構而能與咖啡堿、糖類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等相互作用,并以非共價鍵的形式形成大分子復合物,這也正是用常規(guī)方法難以對普洱茶主要成分進行分析和分離的主要原因。

        鑒于普洱熟茶原料(茶鮮葉或曬青毛茶)的成分清楚,且其發(fā)酵過程(包括發(fā)酵過程中的化學環(huán)境、微生物種類、酶的種類、濕熱作用情況等)已基本明確,不妨嘗試以已知的原料成分和發(fā)酵過程中的化學變化為依據(jù),進而對普洱熟茶成分及其含量進行判定,這可能更易于闡明普洱熟茶的成分組成、保健功效物質(zhì)基礎和作用機理。

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