阮志燕 陳慶鳳 賴滿香

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，廣東廣州 510520

鹽酸芬戈莫德（FTY720）作為一種新型免疫抑制劑治療器官移植[1]和多發(fā)性硬化[2]等免疫性疾病，主要激動(dòng)S1P受體，從而具有特異性免疫抑制功能[3]。近年來，不斷有文獻(xiàn)報(bào)道FTY720可以抑制動(dòng)物模型的腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[4-5]和增強(qiáng)抗癌藥的抗腫瘤活性[6]，抗瘤機(jī)制不盡相同，涉及鞘氨醇激酶、原癌基因等多個(gè)方面[7]。腫瘤細(xì)胞逃避患瘤機(jī)體的免疫殺傷作用一直是抗腫瘤免疫研究的重點(diǎn)，從提高機(jī)體抗腫瘤免疫的角度尋找有效的抗腫瘤藥物是目前的常規(guī)方法。選擇IFN-γ對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[8]和Tregs的免疫抑制功能[9]作為研究腫瘤免疫的主要指標(biāo)。通過檢測(cè)免疫效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-γ的量和Tregs的數(shù)量及免疫抑制功能的變化來觀察腫瘤機(jī)體的免疫狀態(tài)，結(jié)合藥物的抗瘤效果，對(duì)腫瘤模型的免疫狀態(tài)有重要的提示意義[10]。本研究著重于觀察鹽酸芬戈莫德對(duì)荷瘤小鼠腫瘤免疫相關(guān)因子效應(yīng)T細(xì)胞、IFN-γ和Tregs細(xì)胞的影響，以期了解鹽酸芬戈莫德的抑制腫瘤作用。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞和藥物

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26.WT（CT26）；鹽酸芬戈莫德（FTY720，純度≥98%）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)別雌性BALB/c小鼠，6～7周齡，體重（16±2）g，購自于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 主要試劑和儀器

PMA/Ionomycin/BFA/Monensin mixture（250×）（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），I型DNA酶和透明質(zhì)酸酶（上海易立生物科技有限公司），單克隆抗體FITC anti-mouse CD3e、PE-Cy7 anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD25、PE-Cy7 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse IFN-γ、PE anti-mouse IL-10（美國eBioscience公司），流式細(xì)胞儀BD FACSCanto Ⅱ（美國BD公司）。

1.4 結(jié)腸癌小鼠模型的建立及抑瘤效果

使用隨機(jī)數(shù)字表對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，F(xiàn)TY720高、中、低劑量治療組（n=10，共30只）和荷瘤模型組（n=10）接種CT26細(xì)胞，陰性對(duì)照組（n=10）接種生理鹽水。按CT26細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)/只接種，接種后第4天，連續(xù)14d灌胃給藥。

1.5 腫瘤抑制率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的測(cè)定

第14天給藥后24h處死小鼠，摘眼球取外周血、另外取胸腺、脾臟、接種側(cè)腋下淋巴結(jié)和腫瘤組織。胸腺、脾臟和腫瘤精密稱重后計(jì)算腫瘤抑制率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。抑瘤效果使用抑瘤率表示，抑瘤率=（1-鹽酸芬戈莫德治療組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g），胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.6 小鼠不同組織效應(yīng)T細(xì)胞CD8+CD3+T細(xì)胞的比例

在無菌條件下剝離腫塊，濾紙吸凈表面液體，剪碎，玻璃針芯輕柔碾壓，篩網(wǎng)過濾獲取組織細(xì)胞，使用膠原酶、DNA酶和透明質(zhì)酸酶消化6h，再用淋巴細(xì)胞分離液，獲得腫瘤組織來源的淋巴細(xì)胞。單克隆表面抗體CD3和CD8染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

按照下列公式計(jì)算：Teff細(xì)胞數(shù)百分比=（CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)/CD3+細(xì)胞數(shù)）×100%

1.7 小鼠不同組織T細(xì)胞的IFN-γ和CD4+CD25+Tregs IL-10的分泌

按流式細(xì)胞術(shù)處理外周血和淋巴結(jié)樣本取得相應(yīng)細(xì)胞，將收集的外周血、淋巴結(jié)和腫瘤3種來源的淋巴細(xì)胞按5×104個(gè)細(xì)胞/孔鋪板，設(shè)置復(fù)孔3個(gè)，按說明書加入PMA/Ionomycin/BFA/Monensin mixture刺激，37℃，5%CO2，孵育過夜。CD3、CD4和CD25標(biāo)記Treg細(xì)胞，分別進(jìn)行細(xì)胞表面抗原染色和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 for Windows軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)組間比較采用方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較使用q檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

荷瘤模型組剝離的腫塊平均重量為（0.99±0.27）g，F(xiàn)TY720高、中、低劑量治療組的抑瘤率呈劑量正相關(guān)性，最高達(dá)61%，最低為33%，提示FTY720有抑制小鼠實(shí)體腫瘤的生長的作用，F(xiàn)TY720高、中、低劑量治療組、荷瘤模型組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.928，P＜0.05），F(xiàn)TY720不同劑量組和荷瘤模型組比較，腫瘤重量明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 FTY720的抑瘤率（n=10）

2.2 FTY720對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

和陰性對(duì)照組的數(shù)據(jù)相比，小鼠接種CT26腫瘤細(xì)胞后胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；和荷瘤模型組的臟器指數(shù)相比，不同劑量給藥組明顯提高了小鼠的胸腺指數(shù)（F=15.965）和脾臟指數(shù)（F=14.413），尤其是高劑量組的小鼠臟器指數(shù)上升更為顯著，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 FTY720對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響（n=10）

2.3 FTY720對(duì)荷瘤小鼠腫留免疫相關(guān)因子的影響

2.3.1 小鼠不同組織中的CD8+CD3+T細(xì)胞的比例 荷瘤模型組外周血和淋巴結(jié)中Teff細(xì)胞的比例顯著高于陰性對(duì)照組；FTY720不同劑量治療組與荷瘤模型組的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，治療組的外周血（F=59.636）和淋巴結(jié)（F=52.952）Teff細(xì)胞的比例均是下降的，并且下降趨勢(shì)與劑量呈相關(guān)性；觀察腫瘤局部Teff細(xì)胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720高、中劑量治療組與荷瘤模型組的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.985，P ＜ 0.05）。見表 3。

表3 不同組織內(nèi)CD8+CD3+Teff細(xì)胞百分比（n=8）

2.3.2 小鼠不同組織CD3+T細(xì)胞的IFN-γ的分泌 荷瘤模型組的外周血中和淋巴結(jié)中的CD3+T細(xì)胞分泌IFN-γ的比例均比陰性對(duì)照組的數(shù)據(jù)低。不同劑量治療組的數(shù)據(jù)提示，F(xiàn)TY720顯著升高三種不同組織來源的CD3+T細(xì)胞分泌IFN-γ的比例，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且升高的數(shù)值隨著用藥劑量而變化。見圖1。

圖1 分泌IFN-γ的CD3+T細(xì)胞百分比

2.3.3 小鼠不同組織CD4+CD25+Tregs的IL-10分泌 荷瘤模型組的小鼠外周血和淋巴結(jié)的CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的比例相比陰性對(duì)照組顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；鹽酸芬戈莫德顯著降低了CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的細(xì)胞比例，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），用藥劑量越大，降低比例越明顯，提示鹽酸芬戈莫德可以通過減少IL-10的分泌來對(duì)抗腫瘤小鼠CD4+CD25+Tregs的免疫抑制作用。見圖2。

圖2 分泌IL-10的CD4+CD25+Tregs細(xì)胞百分比

3 討論

我們分別從效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量和腫瘤免疫相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子兩個(gè)方面，研究鹽酸芬戈莫德對(duì)結(jié)腸癌小鼠腫瘤免疫相關(guān)因子的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，鹽酸芬戈莫德升高了腫瘤局部CD3+CD8+T細(xì)胞的比例，這些小鼠外周血和淋巴結(jié)、甚至腫瘤局部的CD3+T細(xì)胞分泌IFN-γ的比例明顯增強(qiáng)；Sasidharan報(bào)道Tregs在局部造成的免疫抑制微環(huán)境是幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫殺傷的關(guān)鍵[11]，腫瘤局部Tregs和CD8+T細(xì)胞的此消彼長影響腫瘤的生長[12]；CD8+T的細(xì)胞數(shù)量和IFN-γ的分泌量是衡量機(jī)體抗腫瘤免疫的常見指標(biāo)，治療組的數(shù)據(jù)提示鹽酸芬戈莫德有提高CD8+T的細(xì)胞數(shù)量和IFN-γ的分泌量的作用。

另外一方面，Tregs在腫瘤機(jī)體的免疫抑制作用不只是存在于腫瘤局部，其分泌的細(xì)胞因子IL-10也是抑制抗腫瘤免疫的主要指標(biāo)[13]，在小鼠外周血和腫瘤相關(guān)淋巴結(jié)中的CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的能力增強(qiáng)，意味著荷瘤小鼠腫瘤局部的免疫抑制狀態(tài)較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示鹽酸芬戈莫德顯著降低了外周血和腫瘤引流淋巴結(jié)CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的細(xì)胞比例，可能在腫瘤免疫中起到抑制Tregs功能的作用。

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是反映小鼠機(jī)體整體免疫狀態(tài)的常用指標(biāo)[14]，檢測(cè)臟器指數(shù)從側(cè)面反映鹽酸芬戈莫德對(duì)結(jié)腸癌小鼠腫瘤免疫狀態(tài)的影響。荷瘤模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)數(shù)據(jù)顯示機(jī)體免疫狀態(tài)受到明顯抑制，鹽酸芬戈莫德明顯改善因腫瘤導(dǎo)致的臟器指數(shù)下降。

我們推測(cè)腫瘤的生長受到抑制與以下幾個(gè)方面相關(guān)：胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)回升、CD3+CD8+T細(xì)胞的比例提高、CD3+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平增強(qiáng)以及CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的細(xì)胞比例下降。這些數(shù)據(jù)提示鹽酸芬戈莫德可能加強(qiáng)了荷瘤機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了免疫效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量和功能，抑制了Tregs免疫抑制功能和腫瘤局部Tregs的數(shù)量，從而抑制腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長。

目前鹽酸芬戈莫德的作用靶點(diǎn)尚不清楚，但是其對(duì)Tregs的影響是比較明顯的，其機(jī)制可能是鹽酸芬戈莫德影響了Tregs向腫瘤局部的遷徙[15]。我們的研究也表明，鹽酸芬戈莫德對(duì)結(jié)腸癌模型小鼠體內(nèi)腫瘤免疫因子的影響，提高外周血和淋巴結(jié)中T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力，同時(shí)抑制CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的作用來發(fā)揮作用，這一結(jié)果與Zhao等[16]報(bào)道的炎癥性腸病的結(jié)果類似。