彭鷗，葉長城，劉玉玲，李丹陽，劉壽濤，羅海艷，鐵柏清,*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，長沙 410128 2. 湖南省灌溉水源水質(zhì)污染凈化工程技術研究中心，長沙 410128 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方產(chǎn)地污染防控重點實驗室，長沙 410128

湖南是著名的魚米之鄉(xiāng)，近年來由于受污水灌溉、城市垃圾亂棄及礦產(chǎn)開發(fā)等的影響，湖南地區(qū)受Cd污染較為嚴重，在某些工業(yè)園區(qū)周圍的農(nóng)田土壤中Cd含量達到4.22 mg·kg-1[1]，農(nóng)田Cd污染問題也日益嚴重[2]，對湖南稻米安全生產(chǎn)產(chǎn)生較大威脅。與其他重金屬元素相比，Cd的活性較強，容易被水稻吸收和富集，可以在不影響水稻正常生長的情況下積累較高含量的Cd[3-4]，包括食用的稻米部位，從而威脅食品安全[5-6]。

Cd脅迫下，植物體內(nèi)會形成過量的氧自由基，從而影響抗氧化酶活性，破壞質(zhì)膜系統(tǒng)和生物大分子，抑制植株生長[7]。水稻在Cd脅迫條件下，通過抑制種子中淀粉酶、蛋白酶等的活性，抑制種子內(nèi)淀粉和蛋白質(zhì)的分解，從而影響種子的萌發(fā)[8-9]。一般認為，Cd的這種生長抑制作用與其影響植物體內(nèi)活性氧自由基代謝有關[10-11]。超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內(nèi)清除和減少破壞性氧自由基的保護酶，對于防止氧自由基破壞細胞的組成、結構和功能，保護細胞免受氧化損傷具有十分重要的作用，其活性大小常被用作植株抗氧化能力強弱的指標[12]。丙二醛(MDA)是植物組織在逆境下遭受氧化脅迫發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的積累是自由基毒害作用的表現(xiàn)，因此，MDA可以代表細胞的脂質(zhì)過氧化水平和生物膜損傷程度的大小，反映細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱[13-14]。

鑒于湖南耕地Cd污染現(xiàn)象嚴重，本試驗考察不同濃度梯度Cd2+脅迫對水稻的影響，通過研究Cd脅迫下水稻農(nóng)藝性狀的變化以及葉片SOD活性和MDA含量變化，旨在分析水稻葉片SOD活性和MDA含量與糙米Cd含量的相關性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試品種

供試品種為中嘉早17號(常規(guī)秈稻，全生育期109 d)。水稻幼苗3葉1心后于4月24日移栽，5月3日開始添加外源Cd，到7月21日收獲水稻。

1.2 試驗方法

采用室外盆栽水培試驗，利用營養(yǎng)液對水稻進行全生育期培養(yǎng)，共設置6個不同Cd濃度的處理水平，每個處理水平重復3次，編號為Cd0、Cd10、Cd50、Cd200、Cd500和Cd1000，其營養(yǎng)液中Cd濃度分別保持為0、10.00、50.00、200.00、500.00和1 000.00 μg·L-1。

水稻所需營養(yǎng)液配制方法采用木村B營養(yǎng)液和Arnon(1939)微量元素營養(yǎng)液配制方法[15]。試驗中水稻于盛有基礎營養(yǎng)液10 L的塑料桶中，加入微量元素貯備液10 mL。水稻采用泡沫育苗盤和定植籃固定，每桶5穴，每穴3株。水稻幼苗移栽7 d后開始添加外源Cd，營養(yǎng)液前期5～7 d更換，后期3～4 d更換[16]，每2天用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl調(diào)pH至5.5。

1.3 分析測定與數(shù)據(jù)處理

1.3.1 樣品處理及測定

(1) 農(nóng)藝指標的測定。分別于5月24日(分蘗期)、6月15日(孕穗期)、7月10日(乳熟期)用卷尺測定水稻根長及株高。在7月10日(乳熟期)數(shù)取水稻有效分蘗數(shù)，并取3個重復處理平均值。7月28日水稻風干后稱取水稻產(chǎn)量(以稻谷干重計)。

(2) MDA含量和SOD活性測定。在測量水稻根長株高后，同時取第一片完全展開葉片，用于MDA含量和SOD活性的分析。植株樣品用磷酸緩沖液(pH 7.8)于冰浴中研磨，勻漿在1 000 r·min-1下離心20 min，取上清液，即為MDA和SOD的粗提液[17]。分別測定MDA含量和SOD活性。

(3)水稻Cd含量測定。水稻樣品采集后，先用自來水小心洗凈根系，然后用去離子水清洗整個植株，將植株根系、莖鞘、葉和穗手工分離，在103 ℃殺青1 h，置于烘箱65 ℃烘至恒重，稱取各部位干重。稻谷風干曬干后用礱谷機分離出糙米和稻殼。所有樣品粉碎過100目篩，全部裝入自封袋內(nèi)密封保存?zhèn)溆?。稱取水稻各部位樣品(0.5000±0.0005) g置于消解管中采用混合酸(V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1)濕法消解并定容[18]。采用ICP-OES(美國PE8300)測定Cd含量>0.1 mg·kg-1的水稻樣品；用原子吸收分光光度計-石墨爐法(GTA120，美國Varian)測定Cd含量<0.1 mg·kg-1的水稻樣品。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理方法

運用IMB SPSS(Statistical Product and Service Solutions, 22.0)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理；運用Microsoft Excel 2010軟件制作數(shù)據(jù)表格。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 Cd脅迫下中嘉早17號農(nóng)藝性狀分析

由表1可知，低濃度(10 μg·L-1)Cd脅迫對中嘉早17號生長有一定的促進作用，但與對照差異不顯著；在高濃度(>200 μg·L-1)Cd脅迫下，水稻根長、株高、有效分蘗數(shù)和產(chǎn)量均顯著降低。Cd脅迫濃度<50 μg·L-1時，對水稻未表現(xiàn)出顯著傷害。就水稻生育期來看，Cd脅迫濃度>200 μg·L-1時，水稻生長緩慢，在分蘗期到孕穗期這段時期內(nèi)，Cd1000處理根長僅平均增長1.73 cm、株高僅平均增長28.86 cm，明顯低于低濃度Cd脅迫組和對照組。在乳熟期，Cd脅迫濃度>200 μg·L-1時，株高和根長與對照差異顯著。同時，高濃度Cd脅迫影響水稻分蘗，Cd脅迫濃度>200 μg·L-1時有顯著影響。就水稻產(chǎn)量而言(以稻谷干重計)，低濃度Cd脅迫能增加產(chǎn)量，但效果不顯著，Cd脅迫濃度<50 μg·L-1時，對水稻產(chǎn)量未產(chǎn)生顯著影響，在Cd脅迫濃度>50 μg·L-1時，水稻產(chǎn)量有顯著降低。在1 000 μg·L-1Cd脅迫下水稻不能正常結實，籽?；旧峡瞻T。

2.2 Cd脅迫下中嘉早17號糙米的Cd含量

由圖1可知，中嘉早17號全生育期在不同濃度Cd脅迫下，糙米中Cd含量差異明顯。水稻全生育期在10 μg·L-1Cd脅迫下，水稻成熟后糙米中Cd含量達到0.75 mg·kg-1，遠遠超過國家標準。水稻全生育期在50 μg·L-1Cd脅迫下，水稻成熟后糙米中Cd含量達到1.42 mg·kg-1，是10 μg·L-1Cd處理組糙米Cd含量的1.89倍。200、500和1 000 μg·L-1Cd處理組糙米中Cd含量分別達到2.25、4.20和9.36 mg·kg-1。隨著Cd脅迫濃度增加，糙米Cd含量越大，且呈正相關關系。

表1 Cd脅迫下中嘉早17號農(nóng)藝性狀Table 1 The major agronomic traits of Zhongjiazao 17 rice under cadmium stress

注：Cd0、Cd10、Cd50、Cd200、Cd500和Cd1000表示不同試驗處理濃度分別為0、10.00、50.00、200.00、500.00和1 000.00 μg·L-1；每列小寫字母不同表示不同處理間差異顯著，P<0.05。
Note: Cd0, Cd10, Cd50, Cd200, Cd500, and Cd1000 represent different test treatment concentrations of 0, 10.00, 50.00, 200.00, 500.00, and 1 000.00 μg·L-1; the different lowercase letters in each column indicate significant differences between different treatments,P< 0.05.

圖1 Cd脅迫下中嘉早17號的糙米Cd含量注：小寫字母不同表示不同處理間差異顯著，P<0.05。Fig. 1 Cd content of Zhongjiazao 17 brown rice under Cd stressNote: The different lowercase letters indicate significant differences between treatments, P<0.05.

2.3 Cd脅迫下中嘉早17號SOD活性和MDA含量差異

由表2可知，整個生育過程中，中嘉早17號葉片SOD活性對Cd脅迫有著相同的響應。在水稻的3個主要生育期，不同Cd脅迫處理，SOD活性規(guī)律為Cd1000>Cd500>Cd200>Cd50>Cd10>Cd0。不同生育時期孕穗期SOD活性最低，分蘗期最高，乳熟期次之。在Cd脅迫下水稻SOD活性有如下的變化趨勢：Cd脅迫濃度越高，SOD活性越強；SOD活性在不同生育期表現(xiàn)的規(guī)律為分蘗期>乳熟期>孕穗期。

在Cd脅迫下，各生育期中，中嘉早17號葉片的MDA含量均以Cd1000處理最高，Cd0處理最低，說明高濃度Cd脅迫增加水稻葉片MDA含量。從生育時期看，水稻葉片的MDA含量在水稻生長發(fā)育過程中呈增加趨勢，分蘗期的MDA含量最低，成熟期水稻葉片的MDA含量明顯高于孕穗期。

2.4 Cd脅迫水平下水稻葉片SOD活性及MDA含量與水稻糙米Cd含量的相關性

由圖2可知，水稻在Cd脅迫下糙米Cd含量與各時期SOD活性均顯著相關(P<0.01)。水稻糙米中Cd含量與Cd脅迫濃度呈正相關，SOD活性亦如此。從不同時期來看，在Cd脅迫下分蘗期水稻SOD活性達到最大值，與糙米Cd含量相關系數(shù)r=0.97，且在P<0.01水平下顯著相關。在孕穗期水稻SOD活性較低，但與糙米Cd含量相關性最高，相關系數(shù)r=0.97。水稻在乳熟期SOD活性高于孕穗期，與糙米Cd含量相關性顯著。水稻葉片SOD活性與糙米Cd含量在3個主要時期相關性均顯著。

由圖3可知，水稻在Cd脅迫下糙米Cd含量與各時期MDA含量均極顯著相關(P<0.01)。在Cd脅迫下分蘗期水稻MDA含量最低，與糙米Cd含量相關性顯著(r=0.766)。在水稻孕穗期MDA含量與糙米Cd含量相關系數(shù)r=0.869，且在P<0.01水平下極顯著相關性。在隨著水稻的生長，在乳熟期MDA含量高于前兩個生育期，與糙米Cd含量相關性也越高，相關系數(shù)r=0.945。水稻葉片MDA含量與糙米Cd含量在3個主要時期相關性顯著。

3 討論(Discussion)

低濃度Cd脅迫對水稻生理狀態(tài)無明顯影響，但水稻富集吸收Cd會形成對人類有害的Cd米。本研究表明，低濃度(10 μg·L-1)Cd脅迫對水稻生長有一定促進作用，當Cd脅迫達到一定限度時，會抑制水稻根的生長，使根彎曲，減少根數(shù)等[19]。隨著Cd脅迫濃度的提高，抑制作用會逐漸增強，進而使水稻株高降低、生長遲緩、植株鮮重減小、葉片變黃并出現(xiàn)壞死斑和傷流液量減少等一系列生理狀況[20]。前人研究認為，一定濃度Cd脅迫能顯著降低水稻的產(chǎn)量、結實率和粒重等經(jīng)濟性狀以及不同生育期的地上部干物質(zhì)質(zhì)量[21]。陳志德等[22]的研究表明，Cd對每穗粒數(shù)的影響大，而對穗數(shù)、結實率和千粒重影響小，Cd處理后每穗粒數(shù)降低是各品種籽粒產(chǎn)量降低的主要原因。

表2 Cd脅迫下中嘉早17號葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量Table 2 The superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in leaves of Zhongjiazao 17 rice under cadmium stresses

注：每列小寫字母不同表示不同處理間差異顯著，P<0.05。
Note: The different lowercase letters in each column indicate significant differences between treatments,P<0.05.

圖2 Cd脅迫下中嘉早17號葉片SOD活性與糙米Cd含量相關性注：(a). 分蘗期，(b). 孕穗期，(c). 乳熟期。Fig. 2 Correlation between the SOD activity in leaves and the cadmium content in brown rice in Zhongjiazao 17 rice under cadmium stressesNote: (a). Tillering stage, (b). Booting stage, (c). Milking stage.

在受Cd脅迫的環(huán)境下，Cd會影響水稻的葉綠素含量以及光合系統(tǒng)，并改變MDA含量和SOD、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性[23]。Cd對植物的毒害可能是通過產(chǎn)生H2O2的方式進行的，因此抗氧化酶系統(tǒng)對植物耐Cd脅迫具有重要作用[24]。Cd脅迫可以提高水稻體內(nèi)抗氧化酶的活性，但隨著Cd濃度的增加酶活性逐漸降低[25]，但在本研究中，Cd脅迫濃度越高，水稻SOD活性越強，但在0～1 000 μg·L-1范圍內(nèi)Cd2+脅迫的水稻葉片酶活性沒有降低的趨勢。邵國勝等[10]研究認為，分蘗期是不同基因型水稻SOD活性差異最大的時期，在分蘗期中嘉早17號的SOD活性明顯高于其他2個時期。這表明，水稻生育早期是對Cd脅迫最敏感的時期，隨著生育進程推進，水稻對Cd脅迫的適應性增強，Cd脅迫對SOD活性影響減小。水稻到乳熟期后，因為水稻體內(nèi)Cd含量積累到一定程度，SOD活性則出現(xiàn)了一定的波動。章秀福等[7]的研究表明，水稻植株吸收和積累Cd的能力與酶活性存在負相關關系，但本研究發(fā)現(xiàn)，水稻成熟后糙米中Cd含量與水稻葉片SOD活性呈正相關，且相關性顯著，可以看出抗氧化酶系統(tǒng)在對Cd脅迫的防衛(wèi)機制中具有重要作用，但有一定的濃度限制且存在品種間的差異。本研究表明，隨著Cd脅迫濃度的升高，水稻葉片的MDA含量升高，且MDA含量與糙米中Cd含量呈明顯正相關，這與王昌全等[26]的研究結果一致。隨著Cd脅迫濃度和時間的增加，水稻葉片MDA含量呈逐漸上升的趨勢[27]，且乳熟期的MDA含量最高，孕穗期次之，分蘗期最低。同時，高濃度Cd脅迫比低濃度Cd脅迫更易對水稻造成傷害[28]。隨著Cd脅迫濃度的提高和生育時期的推進，水稻葉片質(zhì)膜的組成和完整性遭到破壞，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，但由于清除自由基的能力下降，引起質(zhì)膜發(fā)生過氧化，MDA含量增加[14]。

圖3 Cd脅迫下中嘉早17號葉片MDA含量與糙米Cd含量相關性注：(a). 分蘗期，(b). 孕穗期，(c). 乳熟期。Fig. 3 Correlation between the MDA content in leaves and the cadmium content in brown rice in Zhongjiazao 17 rice under cadmium stressesNote: (a). Tillering stage, (b). Booting stage, (c). Milking stage.

綜上所述，在Cd脅迫下水稻葉片SOD活性和MDA含量隨Cd脅迫濃度增大而增大，且二者與糙米Cd含量呈顯著正線性相關。