李葒葒，吳敏蘭，賈洋洋，陳春樂，田甜，王果,*

1. 閩南師范大學歷史地理學院，漳州 363000 2. 福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院，福州 350002 3. 漳州城市職業(yè)學院，漳州 363000 4. 三明學院資源與化工學院，三明 365004

砷(As)具有很強的毒性，低水平的砷暴露就會嚴重危害人體健康。 流行病學研究表明，每日攝入0.3～8 μg·kg-1bw就會增加1%肺癌、皮膚癌和膀胱癌的風險[1]。近年來，由于人類開采冶煉活動愈加頻繁，使礦區(qū)周圍的農(nóng)田土壤中砷含量嚴重超標，有報道指出，中國湖北省某有色金屬冶煉廠周圍的土壤中砷含量高達66.38 mg·kg-1[2]。而且土壤中砷可以通過植物富集，進入人類的食物鏈當中，從而對人體健康帶來危害。為了控制砷的健康風險，一些國家制定了食品中砷的限量值或者每周耐受攝入量的標準[1,3-5]，并用作食品中砷的健康風險評估。Jiang等[4]對江蘇地區(qū)人體攝入砷風險的研究表明，超過一半的砷是來自大米的攝入；且歐洲食品安全局(EFSA)也指出通過食用大米進入人體的無機砷占無機砷膳食總攝入量的5%～15%[6]。但對于廣州市居民攝入砷的風險則更多是來自海鮮的攝入，研究表明，通過蝦貝類攝入的砷總量高于大米，且瀨尿蝦、紅蝦、紅蟹和花蟹這4種海鮮對人體攝入砷的風險較大[7]。目前，《中華人民共和國國家標準 食品安全國家標準 食品中污染物限量》(GB2762—2017)對12類食品中總砷或有機砷的含量進行了限制，但其中并不包含煙葉中砷的限量，吸煙也是導致砷暴露的原因之一。煙葉中的砷形態(tài)主要是以As5+為主，占總砷含量的58%；煙葉中的As3+占總砷含量的5%[8]；其他形態(tài)的砷以有機態(tài)形式存在于煙葉中。但是在抽吸的過程中，在煙氣中會產(chǎn)生As3+，而As5+則留在了煙灰當中[9]，進而煙氣中的As3+不僅對吸煙者，而且對于吸二手煙的群體均會產(chǎn)生危害。而煙草是重要葉用經(jīng)濟作物，中國是香煙消費大國，第4次國家衛(wèi)生服務調(diào)查結(jié)果顯示，中國吸煙人數(shù)高達2.7億。且福建省是中國煙草生產(chǎn)大省。因此，探討煙草對砷的吸收能力以及煙葉中的砷對人體帶來的健康風險具有重要意義。

土壤中的砷主要以砷酸鹽(As5+)、亞砷酸鹽(As3+)和有機形態(tài)的砷為主，且As3+的毒性最高[10-11]。土壤pH、土壤氧化還原電位、有機質(zhì)、黏粒含量以及土壤微生物種類等均會影響砷在土壤中的有效性[12]。例如：在砂性土壤上，植物對砷的吸收量會高于黏性土壤[13]；土壤氧化還原電位降低會提高土壤中砷的毒性[14]。除此之外，土壤中的營養(yǎng)元素含量也會影響砷的有效性；當土壤中磷含量較低時，植物根系會分泌較多的酸性物質(zhì)(如蘋果酸、檸檬酸)與磷絡合，提高磷的利用率，而磷與砷是同族元素，導致砷的植物有效性也被提高[15-16]。而且前人研究認為，土壤重金屬的有效性與植物吸收重金屬的含量呈顯著正相關關系[12,17-18]。因此，以土壤有效態(tài)砷含量作為評價植煙土壤的污染程度更加科學。

不同品種的作物對砷的富集能力不同，在其各部位的積累情況也不盡相同。涂德輝等[19]對85份水稻親本材料進行研究發(fā)現(xiàn)，不同水稻材料的砷耐性和砷累積差異較大，有些水稻地上部對砷的累積量甚至可相差18倍。為此，本研究以福建省種植面積較廣的3個煙草品種為試驗材料，通過設置不同砷梯度的盆栽試驗，探討砷對煙草的毒害效應以及砷在土壤-煙草各部位中的轉(zhuǎn)移規(guī)律，以期對煙草的安全生產(chǎn)提供技術指導。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

本研究所采用的土壤來自福建省福州市閩侯區(qū)未受污染的農(nóng)田土壤，在野外將農(nóng)田表層20 cm的耕作層土壤挖取，并在通風良好的室內(nèi)風干、研碎，過2 cm的網(wǎng)篩。在混勻的土壤樣品中取部分土壤，用磨土棒磨碎，過2 mm的尼龍篩網(wǎng)；再從2 mm土壤中取50 g，用瑪瑙研缽研磨，并過0.149 mm的尼龍篩網(wǎng)，分別進行土壤理化分析。土壤的基本理化性質(zhì)如表1所示。土壤pH采用pH計(SevenCompact, Mettler-Toledo, Greifensee, Switzerland)進行測定，土水比為1∶5(w/V)；土壤的陽離子交換量(CEC)用乙酸銨交換法進行測定；土壤有機質(zhì)采用硫酸-重鉻酸鉀外加熱法；土壤顆粒組成采用比重計測定；以上方法參照鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》[20]。

本研究所用的煙草(NicotianatabacumL.)幼苗來自福建省煙科所，3個煙草品種分別為翠碧1號、K326和云煙87，是福建省的主栽品種。所用的試劑為NaAsO2(分析純)，購自國藥化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

本研究采用3個煙草品種，每個煙草品種均設置6個外源砷添加梯度，分別為：0 (CK)、10 (T1)、20 (T2)、40 (T3)、70 (T4)和100 mg·kg-1(T5)。將風干后過2 cm篩的土壤裝入預先準備的桶(直徑為20 cm，高30 cm)內(nèi)，每桶裝9 kg土壤。每個處理設置3個重復，共54桶。砷酸鈉以溶液的形式與土壤混合均勻，同時每桶施煙草專用肥3.3 g和鈣鎂磷肥0.78 g作為底肥。混合均勻，平衡15 d后移栽幼苗。

移栽時，選擇長勢一致的幼苗，每桶種植1株。在煙草種植過程中，保持土壤濕潤，且觀察記錄煙草的生長情況。在煙草生長的各個時期測量煙草的生長高度，包括移栽期(移栽后19 d)、團棵期(移栽后40 d)、旺長期(移栽后54 d)、現(xiàn)蕾期(移栽后75 d)和成熟期(移栽后101 d)，并在旺長期對煙草的生長情況進行拍照。在煙草移栽69 d時采收煙草下部葉，移栽93 d時采收中部葉，移栽101 d時測定煙草高度并采收上部葉、莖和根系。各部位的煙草樣品用超純水清洗之后晾干，稱取樣品鮮重；之后放入烘箱在105 ℃下殺青30 min，再以65 ℃烘干，稱取煙草各部位干重，然后粉碎、保存待用。

1.3 煙草樣品中砷含量的測定

煙草樣品中的砷含量采用濕式消解-原子熒光分光光度計法進行測定[21]，土壤有效砷含量采用磷酸二氫鈉浸提、原子熒光分光光度計法測定[22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS19.0軟件，作圖采用SigmaPlot 12.5。

耐性指數(shù)=(處理/對照)×100%

煙草各部位間砷的轉(zhuǎn)移系數(shù)(TFa-b) = b部位砷含量(mg·kg-1)/a部位砷含量(mg·kg-1)

砷從土壤到根系的轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF土-根)= 根系中砷含量(mg·kg-1)/土壤有效砷含量(mg·kg-1)

煙草各部位砷富集量(μg·株-1) = 煙草各部位砷含量(mg·kg-1)×相應部位干重(g)

砷通過吸煙進入人體的量(P)=wWT

式中：P為每日通過吸煙進入人體的砷含量(μg)，w為砷在煙葉中的含量(mg·kg-1)，W為人均消費煙量(g)，T為烤煙中砷在人體中的殘留率(%)。

中部葉砷含量與土壤有效砷含量的相關性分析所用的數(shù)據(jù)為各個重復組的試驗數(shù)值，每個品種有6個處理，每個處理3重復，共18組數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 砷對3種煙草生長的影響

砷對煙草的毒害外觀癥狀較為明顯，表現(xiàn)為根條數(shù)減少，根系變短，根重量、根體積均下降，高濃度的砷毒害使植株變得矮小，葉片失綠發(fā)黃，植株長勢弱。這是由于煙草在高濃度砷毒害作用下會導致凈光合速率下降，葉綠素含量、水分利用率、RuBP羧化效率以及光能利用效率等均降低[23]。而且砷對煙草不同生長時期株高的影響不同(圖1)，在移栽期和成熟期時，砷對煙草株高的影響不顯著；但在團棵期、旺長期和現(xiàn)蕾期，隨著砷添加量的增加，煙草株高表現(xiàn)為顯著降低(P<0.05)。從煙草在旺長期的照片可以看出，當砷添加量為70和100 mg·kg-1時，煙草的生長受到明顯的抑制。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of the soil

圖1 砷對煙草不同生長時期株高的影響注：CK、T1、T2、T3、T4和T5組中砷添加量為0、10、20、40、70和100 mg·kg-1；圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n = 3)，采用Duncan’s多重比較方法進行顯著性差異性分析，不同英文字母表示株高顯著差異(P<0.05)；圖(d)為旺長期K326煙草品種的照片記錄。Fig. 1 The effects of arsenic on the height of tobacco in different growth stageNote: In the CK, T1, T2, T3, T4 and T5 group, the As addition is 0, 10, 20, 40, 70 and 100 mg·kg-1, respectively; different letters above each bar indicate significant differences (P<0.05) among the treatments according to Duncan’s multiple range test; data showed as the means ± SD (n = 3); (d) was the photo of K326 at the flourishing stage.

為了探討煙草受砷毒害的情況，對比了不同濃度砷脅迫下3種煙草的株高(現(xiàn)蕾期)、地上部生物量(鮮重)和根部生物量(鮮重)3個生長效應指標的耐性指數(shù)并作相關分析。研究表明，低濃度砷(0～20 mg·kg-1)對部分煙草(翠碧1號、云煙87)的生長有一定的促進作用，但是隨著砷處理濃度的升高，煙草株高、根部和上部葉生物量的受抑程度也逐漸增大。相似的結(jié)果在印度芥菜、藍藻、水稻和水花生等的研究中也得到證實[24-26]。前人的研究表明，低濃度的砷脅迫能夠提高植物葉片的光合速率，但過多的砷進入植物體內(nèi)時，會損害其細胞器，導致葉綠體功能失調(diào)[26-27]。砷對煙草的影響因品種不同而異，如表2所示。在0～100 mg·kg-1砷處理下，翠碧1號株高、地上部鮮重和根鮮重的耐性指數(shù)變幅分別為107.8%～74.45%、108.3%～91.34%和100.0%～66.11%；K326的三者耐性指數(shù)變幅分別為100.0%～63.72%、102.7%～89.19%和100.0%～60.02%；云煙87的三者耐性指數(shù)變幅分別為101.7%～81.44%、103.0%～96.02%和100.0%～62.68%，顯然根受砷毒害的敏感性高于地上部鮮重和株高。

2.2 砷在煙草不同部位的分布

植物體內(nèi)的砷含量與土壤有效態(tài)砷含量之間存在相關性[28]，因此，本研究對土壤有效砷進行分析。土壤有效砷的浸提劑有很多，如NH4Cl、(NH4)2SO4、HCl、NaHCO3和NaH2PO4等[29-30]。本研究按照福建省地方標準《酸性土壤中有效砷、有效汞的測定原子熒光法》(DB35/T 1459—2014)[16]，采用NaH2PO4溶液進行浸提。由于磷與砷為同族元素，電子分布較相似，且都能形成三元酸，但砷酸根和亞砷酸根的半徑比磷酸根大，磷酸根還具有較強的電荷密度，所以磷酸根可以替換土壤顆粒表面的砷[16,30]。從表3中可知，隨著砷添加量的提高，土壤中NaH2PO4浸提的有效態(tài)砷含量表現(xiàn)為顯著增加的趨勢，當砷的外源添加量達到100 mg·kg-1時，土壤中有效態(tài)砷含量約為30 mg·kg-1，約是對照的120倍。而且隨著土壤有效態(tài)砷含量的提高，煙草各部位砷含量表現(xiàn)為顯著增加的趨勢。以翠碧1號為例，當砷的外源添加量達到100 mg·kg-1時，根、莖、下部葉、中部葉和上部葉中砷含量分別是對照的54.66倍、29.92倍、60.9倍、47.92倍和60.5倍。同一砷添加量的煙草植株各部位砷含量存在明顯差異，其大小順序為：根>葉>莖。其中根最為突出，砷含量明顯高于其他部位；而莖中的砷含量最低。這與前人研究結(jié)果一致，吳玉萍等[31]發(fā)現(xiàn)烤煙各部位砷含量大小順序為下部葉>下部葉脈、中部葉片>上部葉片>中部葉脈>上部葉脈>莖。這表明，砷在煙草體內(nèi)的累積主要是根和葉片，而葉片又是煙草收獲的重要部位。在砷添加量少于40 mg·kg-1時，上部葉的砷含量較少，當砷的添加量大于40 mg·kg-1時，上部葉的砷含量高于中、下部位，說明土壤砷含量超過40 mg·kg-1時，會促進砷往上部葉中的遷移。

表2 不同砷處理濃度下3種煙草的耐性指數(shù)Table 2 Tolerance indexes of the tobaccos under arsenic stress

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n= 3)，采用Duncan’s多重比較方法進行顯著性差異性分析，同列不同英文字母表示耐性指數(shù)顯著差異(P<0.05)。
Note: Data in the table are represented as mean ± S.D., different letters in the same column indicate signicifant difference (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

表3 砷在煙草體內(nèi)含量的分布Table 3 The concentrations of arsenic in tobacco tissues

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n= 3)，采用Duncan’s多重比較方法進行顯著性差異性分析，同列不同英文字母表示顯著差異(P<0.05)。
Note: Data in the table are represented as mean ± S.D., different letters in the same column indicate signicifant difference (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

2.3 砷從土壤到煙草各部位的轉(zhuǎn)移系數(shù)

砷從土壤轉(zhuǎn)移到植物的可食用部位是其進入人類食物鏈的關鍵環(huán)節(jié)[32]。往往砷從土壤到植物體內(nèi)的遷移需要經(jīng)過根系的吸收，再通過韌皮部運輸?shù)角o中，進而分配到各部位的葉片中[33-34]。表4為不同外源砷添加量下，砷從土壤到根系、根系到莖、莖到下部葉、莖到中部葉和莖到上部葉的轉(zhuǎn)移系數(shù)。前人研究表明，與土壤砷全量相比，土壤有效砷含量與植物體內(nèi)砷含量的相關性更好[32,35-36]，因此，本研究采用土壤有效砷含量來計算砷從土壤到根系的轉(zhuǎn)移系數(shù)。從表中可知，在未添加砷的處理中，各部位的轉(zhuǎn)移系數(shù)由大到小依次為：TF(土-根)> TF(莖-中部葉)> TF(莖-下部葉)> TF(莖-上部葉)> TF(根-莖)。當土壤中添加外源砷時，砷在各部位間的轉(zhuǎn)移系數(shù)大致表現(xiàn)為：TF(莖-葉)> TF(土-根)> TF(根-莖)，可見，外源砷添加改變了砷在土壤-煙草體系中的遷移，促進了砷從莖到葉片中的轉(zhuǎn)移。且外源砷添加量為10～70 mg·kg-1時，砷在3種煙草中莖到葉的轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF(莖-上部葉)、TF(莖-中部葉)和TF(莖-下部葉))均隨著添加量的增加而增加；但與添加量為70 mg·kg-1相比，當添加量達到100 mg·kg-1時，3種煙草的TF(土-根)增加，而TF(莖-上部葉)、TF(莖-中部葉)和TF(莖-下部葉)均降低。這說明，在高濃度砷(100 mg·kg-1)毒害下，雖然有較多的砷進入到煙草體內(nèi)，但砷從煙草莖到葉片中的轉(zhuǎn)移受到抑制。這可能是煙草對高濃度砷毒害的一種自我保護機制，減少砷進入葉片中。研究表明，植物在受到砷毒害時，植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧物酶(APX)、過氧化物酶(POD)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性均明顯上調(diào)，從而排除自由基對植物細胞膜的氧傷害[37]。另外，外源砷進入到植物細胞中會與植物螯合蛋白結(jié)合形成低分子復合物，再被運送到液泡中，以此降低植物體中砷的移動性[38]。

表4 砷在土壤-煙草系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF)Table 4 Transfer factors (TF) of arsenic in soil-tobacco system

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，采用Duncan’s多重比較方法進行顯著性差異性分析，同列不同英文字母表示顯著差異(P<0.05)。
Note: Data in the table are represented as mean ± S.D., different letters in the same column indicate signicifant difference (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

2.4 砷在煙草各部位的富集量

煙草各部位砷的富集量是通過各部位砷含量與其干重的乘積計算得到的，具體數(shù)值如表5所示。從表中可知，3種煙草各部位砷富集量由高到低依次為：根>莖>中部葉>下部葉>上部葉，有38.28%～74.37%的砷富集在根系當中，而只有4.61%～11.7%的砷富集在上部葉中。在對照處理中，砷在3種煙草體內(nèi)的總富集量分別為K326(15.23 μg)>翠碧1號(11.82 μg)>云煙87(7.68 μg)。雖然高濃度的砷會抑制煙草的生長，但在煙草體內(nèi)的濃度也隨之增加；因此，隨著外源砷添加的增加，砷在煙草體內(nèi)的富集量總體表現(xiàn)為顯著提高。當外源砷添加達到100 mg·kg-1時，3種煙草體內(nèi)的砷總富集量分別為翠碧1號(467.4 μg)>云煙87(333.5 μg)>K326(325.0 μg)；與對照相比，分別提高了39.54倍、42.32倍和28.21倍。砷在煙草各部位的富集量也隨添加量的增加而表現(xiàn)出顯著提高的趨勢，尤其是上部葉中砷的富集量增加最為顯著；以云煙87為例，與對照相比，砷添加量為100 mg·kg-1時，砷在煙草根、莖、下部葉、中部葉和上部葉中的富集量分別提高了35.33倍、38.70倍、42.20倍、81.11倍和173.7倍，這表明，土壤中砷濃度的提高促進了砷在葉片中富集，尤其是上部葉。

表5 砷在煙草各部位的富集量Table 5 The accumulations of arsenic in tobacco tissues

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，采用Duncan’s多重比較方法進行顯著性差異性分析，同列不同英文字母表示顯著差異(P<0.05)。
Note: Data in the table are represented as mean ± S.D., different letters in same column indicate significant difference (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

2.5 植煙土壤有效砷安全臨界值的計算

《中華人民共和國國家標準 食品安全國家標準 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)對谷物、蔬菜、食用菌、肉制品、乳制品和飲料等食品中砷的總量進行限制，但標準中并未涉及煙葉及其制品的限值。國際糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)的食品添加劑聯(lián)合專家委員會規(guī)定每周耐受無機砷攝入量為15 μg·kg-1BW。根據(jù)《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告(2015年)》，中國成年男性和女性平均體重分別為66.2和57.3 kg。雖然吸煙群體大多為男性，但女性吸煙群體也不在少數(shù)；《第四次國家衛(wèi)生服務調(diào)查分析報告》中指出：在調(diào)查地區(qū)15歲及以上人口男性吸煙率為48.0%，女性吸煙率為2.6%。本研究分別計算男性和女性吸煙者從煙草中吸收砷的限量。男性每人每日最多可攝入砷的量為141.9 μg，女性每人每日最多可攝入砷的量為122.8 μg。若吸煙者對砷的攝入有10%是來自吸煙[39]，則男性和女性吸煙者每人每日從煙草中吸收砷的限量分別為14.2和12.3 μg。而市場上較為常見規(guī)格的濾嘴煙質(zhì)量為0.92 g·支-1，其中煙絲質(zhì)量為0.70 g·支-1[40]。根據(jù)《第三次國家衛(wèi)生服務調(diào)查分析報告》，吸煙者平均每人每天吸煙量為15.9支，但《第四次國家衛(wèi)生服務調(diào)查分析報告》顯示，每天吸煙20支以上的煙民高達61.6%，與第三次衛(wèi)生服務調(diào)查結(jié)果相比，吸煙者的吸煙量明顯增加。因此，假設每人每天吸煙量為20支，則每人每天抽吸的煙絲量為14 g。吸煙時，煙氣中砷含量占香煙砷含量的30.9%[41]。根據(jù)最差情景假設，進入人體的煙氣中，砷的生物利用率為100%；則烤煙中砷在人體的殘留率為30.9%。因此，根據(jù)吸煙進入人體的砷含量，可推算出砷在煙草中最高限量。為保證女性吸煙者不受砷毒害，則砷在煙草中的最高限量為2.84 mg·kg-1，為保證男性吸煙者健康，則砷在煙草中的最高限量為3.28 mg·kg-1。綜上，為保證全體吸煙者避免香煙的砷毒害，砷在煙草中的最高限量為2.84 mg·kg-1。

由于煙草葉片是煙絲的生產(chǎn)原料，且中部葉是煙葉收獲的主要組成部分，因此，本研究將煙草中部葉作為代表部位。根據(jù)3個煙草品種的中部葉砷含量和土壤有效態(tài)砷含量的相關關系，建立回歸方程，如圖2所示。當煙草中砷含量為2.84 mg·kg-1時，種植煙草翠碧1號、K326和云煙87的土壤有效砷含量分別為14.17、14.31和11.86 mg·kg-1。因此，為了降低吸煙者對煙草的砷攝入風險，本研究將云煙87的安全臨界值11.86 mg·kg-1(NaH2PO4浸提)作為福建省植煙土壤有效砷含量的安全臨界值。

圖2 中部葉砷含量與土壤有效砷含量的相關性Fig. 2 Correlationships between the contents of As in middle leaves and soil available As concentrations

綜上，本研究得到以下結(jié)論：

(1)隨著外源砷含量的提高，煙草的株高、植物鮮重均受到抑制，且根受砷毒害的敏感性高于地上部鮮重和株高。砷對3種煙草根生長的抑制程度為K326>云煙87>翠碧1號。

(2)隨著外源砷添加量的增加，土壤中有效態(tài)砷含量和煙草各部位中砷含量均隨之增加。且砷在煙草各部位中的含量表現(xiàn)為根>葉>莖。土壤中添加外源砷時，各部位間砷的轉(zhuǎn)移系數(shù)大致表現(xiàn)為TF(莖-葉)> TF(土-根)> TF(根-莖)。外源砷的增加促進砷從莖到葉片中轉(zhuǎn)移。砷在煙草各部位中的富集量由高到低依次為根>莖>中部葉>下部葉>上部葉；大部分的砷(38.28%～74.37%)富集在煙草根部。

(3)根據(jù)通過吸煙進入人體砷的限量以及土壤有效砷含量與煙草中部葉砷含量的回歸模型，推算出翠碧1號、K326和云煙87這3種煙草的植煙土壤砷的安全臨界值分別為14.17、14.31和11.86 mg·kg-1(NaH2PO4浸提)。并將福建省植煙土壤有效砷的安全臨界值擬定為11.86 mg·kg-1(NaH2PO4浸提)。