廖文，汪光，李開明，陳中穎

1. 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，國家環(huán)境保護(hù)水環(huán)境模擬與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510655 2. 廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510655 3. 中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，廣州 510640

硒(Se)是人體必需的微量元素。研究表明，大米和海鮮類是人體從食品中攝取硒的主要來源[1-2]。然而隨著工業(yè)現(xiàn)代化、農(nóng)村城鎮(zhèn)化和養(yǎng)殖業(yè)集約化的發(fā)展，人們向環(huán)境中排放各種廢水、廢氣和廢渣，導(dǎo)致環(huán)境污染日趨嚴(yán)重。作為食物鏈最頂端的人類，在從食品中攝取營養(yǎng)的同時(shí)，也暴露在污染物的風(fēng)險(xiǎn)中。食品中的有害或有利微量元素從腸道吸收后在體內(nèi)被運(yùn)輸至目標(biāo)組織，產(chǎn)生毒害作用或發(fā)揮健康功能[3]。砷(As)是一種類金屬元素，在自然界中普遍存在，其通過污染的水體、食物和空氣經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后，隨血液流動(dòng)分布于全身各組織器官，過量砷暴露或微量砷的長期暴露都會(huì)對(duì)植物、動(dòng)物和人體產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)而引發(fā)多器官組織和功能的異常變化，導(dǎo)致急性或慢性砷中毒[4-6]。大米作為我國居民的主要膳食組成，其安全性與居民的健康息息相關(guān)[7]。調(diào)查顯示，我國谷類作物中含砷量為70～830 μg·kg-1，某些砷污染嚴(yán)重的地區(qū)如湖南郴州，水稻籽粒中砷的含量高達(dá)7 500 μg·kg-1，是稻米中砷安全標(biāo)準(zhǔn)推薦值的75倍[8]。因此，大米作為食品砷暴露的主要途徑，越來越受到國內(nèi)外重視[9-17]。另一方面，砷能夠在海產(chǎn)品中富集，目前不少研究顯示可食性海藻(海帶、紫菜等)、魚類和貝類等海產(chǎn)品中砷的含量較高，長期攝入這些海產(chǎn)品能導(dǎo)致一定的健康風(fēng)險(xiǎn)，可能造成人體砷慢性中毒[18-24]。

生物有效性(bioavailability)是指被人體吸收后進(jìn)入血液，然后在體內(nèi)重新分布的污染物或營養(yǎng)物的含量與攝入總量的比例。生物有效性測定一般通過動(dòng)物或人體活體實(shí)驗(yàn)(invivo)得到，但是實(shí)驗(yàn)周期長、過程難控制[25]，因此，采用體外模擬實(shí)驗(yàn)(invitro)代替，獲得污染物最大經(jīng)口生物有效性的指示，即生物可給性(bioaccessibility)。生物可給性即污染物或營養(yǎng)物在胃腸環(huán)境中可以溶出的比例，基于invitro方法模擬人體消化系統(tǒng)(主要是胃和小腸)，采用與人體生理?xiàng)l件一致或相接近的人工合成消化液(唾液、胃液和小腸液等)來浸提不同基質(zhì)中的污染物，測定污染物溶出量，得出污染物的生物可給性[26]；該方法操作簡單、實(shí)驗(yàn)周期短、費(fèi)用低廉、實(shí)驗(yàn)條件易于操作、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好，同時(shí)得到的生物可給性能夠很好地?cái)M合invivo方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[27]，因此被廣泛地應(yīng)用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程和消化液成分的不同有不同的invitro方法，主要包括IVG法(InVitroGastrointestinal)、SBRC法(Solubility Bioaccessibility Research Consortium Assay)、DIN法(Ruhr-Universit?t Bochum, Germany)、PBET法(Physiologically Based Extraction Test)和SHIME法(Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystems of Infants)等[28]。其中，生理原理提取法PBET法是基于生理提取來獲得生物可給性的方法，能較好地模擬實(shí)際胃腸消化，且步驟簡單，與invivo得到的土壤和食品中砷、鉛和其他微量元素的生物有效數(shù)據(jù)擬合性較為理想[29]。近年來關(guān)于食品中砷的生物可給性方面已有一定的研究基礎(chǔ)[3-4,18,25-32]。但是研究所獲得的結(jié)果不一，例如食品中砷的生物可給性為36%～99%，這可能與食品基質(zhì)以及采用的研究方法不同有關(guān)[28]。而關(guān)于硒的生物可給性雖有研究，但主要集中在海鮮的研究[33-34]，關(guān)于大米的研究仍然較少。目前的研究結(jié)果表明，魚肉中硒的生物可給性為50%～83%[33-34]。

本研究對(duì)廣州市場上采集的大米和魚肉進(jìn)行處理后測定砷和硒的濃度，并采用PBET方法模擬胃腸消化后，分析總砷和總硒的生物可給性，最后在此基礎(chǔ)上對(duì)食品中砷和硒的健康有益性/風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)比初始濃度和生物可給濃度下的健康有益性/風(fēng)險(xiǎn)以及砷的致癌風(fēng)險(xiǎn)，以期為更為準(zhǔn)確評(píng)估砷及硒的健康風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

在廣州市場采集大米樣品共26種，其中，廣東省11種、江西省3種、東北地區(qū)6種、四川省3種和廣西壯族自治區(qū)3種。采集后的大米樣品自然晾干，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，裝袋密封儲(chǔ)存于干燥器中備用。測定總砷和總硒濃度后選取其中3個(gè)濃度梯度的大米進(jìn)行生物可給性實(shí)驗(yàn)。

在廣州某2個(gè)海鮮市場及超市采集鱭魚(廣州南沙，人工養(yǎng)殖)、老虎斑(珠海，人工養(yǎng)殖)和多寶魚(珠海，人工養(yǎng)殖)。采集的魚樣品去皮、骨頭等，清水洗后用超純水沖洗3次，然后絞碎肌肉，于-20 ℃下預(yù)冷凍12 h后，一部分放入真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA 1-2，CHRIST，德國)內(nèi)冷凍干燥72 h，獲得凍干樣品，另一部分在-80 ℃下保存。

1.2 樣品測定[35]

準(zhǔn)確稱取粉碎后的大米樣品0.4 g或取魚肉樣品(未凍干樣品0.5 g；凍干樣品0.2 g)，加入4 mL硝酸靜置直至樣品基本溶于硝酸中(4～6 h)，然后加入1 mL雙氧水，之后使用微波消解儀(Mars6，CEM，美國)在最大功率1 600 W條件下進(jìn)行梯度消解40 min(各消解溫度下的爬升時(shí)間和停留時(shí)間分別為120 ℃：6 min，5 min；150 ℃：5 min，5 min；180 ℃：4 min，15 min)。消解液定容至50 mL，采用0.22 μm水系膜過濾后待測。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與空白采用同樣方式消解，每個(gè)平行3份樣品。

實(shí)驗(yàn)中砷和硒濃度采用ICP-MS(ICP-MS 7700，Agilent，美國)測定。ICP-MS的工作參數(shù)如表1所示。采用碰撞反應(yīng)池模式，通入氦氣(5 mL·min-1)消除40Ar35Cl的干擾。實(shí)驗(yàn)采用5%硝酸逐級(jí)稀釋砷和硒混合標(biāo)準(zhǔn)液，由于食品中砷和硒的濃度很低，砷和硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度梯度分別為0.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg·L-1。選用72Ge作為內(nèi)標(biāo)(10 μg·L-1)，在線加入。實(shí)驗(yàn)測得砷和硒標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.9999以上。測定空白樣(5%硝酸)，計(jì)算11次測定值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的分析物的濃度值，即為檢出限[36]，本研究中計(jì)算得到的砷和硒檢出限分別為0.093和0.0022 μg·L-1。

采用大米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10043)、狗鯊魚肉(NRC DORM-2)和魚蛋白(NRC DORM-4)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(均購自中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，北京)用于保證方法的準(zhǔn)確性，總量測定實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與其他樣品在相同條件下萃取其中的砷和硒，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中砷和硒的標(biāo)準(zhǔn)含量的比值可得出方法的回收率，分別為82%～115%和91%～107%。

1.3 in vitro生物可給性實(shí)驗(yàn)

食品中砷和硒的生物可給性實(shí)驗(yàn)基于體外模擬胃-腸兩階段消化(PBET)[25]，實(shí)驗(yàn)中所用到的化學(xué)物質(zhì)，除特別說明，均來自Sigma-Aldrich公司，為分析純及以上。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q Element，Millipore，美國，電阻率≥18.2 mΩ·cm)，所用到的器皿均采用20%硝酸浸泡24 h后洗凈待用。

每個(gè)反應(yīng)罐中加入500 mL模擬胃液(1 L超純水+1.25 g胃蛋白酶+0.5 g檸檬酸鈉+0.5 g蘋果酸+420 μL乳酸+500 μL乙酸，并用12 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH值至2)，取5 g大米或魚肉凍干樣品，通氬氣1～2 min，開始計(jì)時(shí)，在37 ℃的溶出試驗(yàn)儀中以150 r·min-1旋渦震蕩1 h；旋轉(zhuǎn)條件下取30 mL消化液。在進(jìn)入腸階段前，先用飽和NaHCO3溶液將pH值調(diào)至5.3，然后在每個(gè)反應(yīng)罐中加入0.875 g膽酸鈉(m(食物樣品)∶m(膽酸鈉)=1∶0.175)和0.25 g胰酶(m(食物樣品)：m(胰酶)=1∶0.05)；再用1 mol·L-1的NaOH將pH值調(diào)至7.0；在37 ℃的溶出試驗(yàn)儀中以150 r·min-1旋渦震蕩2 h；旋轉(zhuǎn)條件下取30 mL消化液。消化液在5 000×g離心15 min，上清液采用0.22 μm水系膜過濾后，采用ICP-MS測定砷和硒。

表1 ICP-MS儀器的工作參數(shù)Table 1 ICP-MS instrument parameters

1.4 生物可給性及健康風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算

根據(jù)樣品測定結(jié)果，食品中砷和硒的生物可給性可按照以下公式計(jì)算[24]：

(1)

為了評(píng)價(jià)魚肉中砷和硒的健康有益性/風(fēng)險(xiǎn)及砷的致癌風(fēng)險(xiǎn)，采用每日攝入量(EDI)及目標(biāo)癌癥風(fēng)險(xiǎn)(TR)[37-38]：

(2)

(3)

式中：DC為每日大米或魚肉攝入量(g·d-1)；Ci為大米或魚肉中的砷或硒濃度或者生物可給濃度(μg·g-1)；BW為人的體重(成人60 kg，小孩32.5 kg)[39]。小孩和成人大米攝入量分別為277和389 g·d-1，廣東省成人魚肉攝入量為60 g·d-1，小孩魚肉攝入量為41 g·d-1[39]。EF為暴露頻率(365 d·a-1)，ET是暴露時(shí)間(70 a)，AT為平均暴露天數(shù)(25 550 d)，CSF為癌癥斜率系數(shù)(1.5 (mg·kg-1·d-1)-1)，可接受或可容忍的風(fēng)險(xiǎn)為10-4[38]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0和OriginLab 9.0分析數(shù)據(jù)。采用單向方差分析顯著性，當(dāng)P<0.05，則認(rèn)為具有顯著性。所有的數(shù)據(jù)采用平均值或者平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。所有質(zhì)量濃度均為干重形式。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 食品中砷的含量和生物可給性

選取的3種大米中砷的平均濃度為0.085、0.121和0.168 μg·g-1。Zhuang等[9]在華南地區(qū)采集3種不同品牌大米進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，市場售賣的大米中砷的濃度為0.086～0.156 μg·g-1，與本研究大米中砷的濃度相似。綠色食品大米標(biāo)準(zhǔn)(NY/T418—2000)中規(guī)定砷濃度≤0.40 μg·g-1，從已有樣品的砷含量來看，廣州市場大米總砷含量均滿足綠色食品大米標(biāo)準(zhǔn)。

魚肉中砷的含量較高，鱭魚(大)、老虎斑和多寶魚中砷的平均濃度分別為2.224、4.649和5.533 μg·g-1，根據(jù)含水率核算得到濕重下3種魚肉中砷的平均濃度分別為0.433、1.100和1.030 μg·g-1。Zhang等[22]對(duì)深圳某海水養(yǎng)殖區(qū)的河豚和石斑魚進(jìn)行檢測，其中肌肉組織中砷的含量(干重)分別為1.04～1.86和2.59～7.85 μg·g-1，與本研究中的多寶魚和老虎斑的結(jié)果類似。

來自同一海域的不同的魚體中砷的濃度不一，這可能與不同魚類代謝的方式和程度以及不同棲息和攝食習(xí)性等有關(guān)。已有研究表明，海水魚中重金屬的平均濃度大于淡水魚[40]，肉食性魚中重金屬的含量大于雜食性和草食性魚[41]。老虎斑是典型的肉食性海魚類，主要攝食魚、蝦、蟹和章魚等海洋生物；多寶魚攝食甲殼類、小魚和蝦等；鱭魚屬河口性洄游魚類。因此，濕重形式下老虎斑濃度最大。

由圖1可知，大米中的砷生物可給性為86.86%～99.34%，而魚肉中砷的生物可給性相對(duì)來說較低，為51.95%～75.64%。大米和魚肉中砷的生物可給性相異的原因可能在于砷在不同食品中分布的形態(tài)不一樣。研究表明，當(dāng)食品中無機(jī)砷的生物可給性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他形態(tài)的砷[30]。Huang等[42]曾報(bào)道，無機(jī)砷為我國大米中砷的主要形態(tài)，占比約為78.3%左右。而水產(chǎn)品(如魚肉)中砷的主要形態(tài)為砷甜菜堿，同時(shí)有部分的二甲基砷酸鹽[21]。

2.2 食品中硒的含量和生物可給性

大米和魚肉中硒的含量列于表2中。3種大米中硒的含量為0.098～0.190 μg·g-1，高于Chen等[1]的研究中廣東省售賣的大米中硒的平均含量，為(0.0039±0.0018) μg·g-1。而魚肉中硒的含量為1.641～2.315 μg·g-1干重，與其他文獻(xiàn)中關(guān)于魚肉硒含量的報(bào)道相似[2]。由圖2可知，大米中硒的生物可給性為76.73%～85.44%，而魚肉中硒的生物可給性為71.48%～79.83%。食品中硒的生物可給性也與其化學(xué)形態(tài)有關(guān)。食品中，在大米中硒的主要形態(tài)為硒代蛋氨酸(SeMet)，而在魚肉中硒的主要形態(tài)為硒代半胱氨酸(SeCys2)[2,43]。Khanam和Platel[34]曾報(bào)道，SeMet的生物可給性要大于SeCys2。因此，大米中硒的生物可給性大于魚肉樣品中硒的生物可給性。

對(duì)比砷和硒胃生物可給性和胃腸生物可給性的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，相較于胃消化，完成模擬胃腸階段消化后，食品中砷和硒的生物可給性均有所上升(圖1和圖2)。這是因?yàn)?，在酸性條件下(pH=2.0)，胃蛋白酶接受更多的氫離子使其更好地打破肽鍵，將蛋白質(zhì)水解。而在腸消化階段，pH調(diào)至pH=5.3～7.0，胰液中的酶催化多糖被水解形成單糖，并進(jìn)一步破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，形成自由氨基酸和縮氨酸，促進(jìn)了結(jié)合在蛋白質(zhì)上砷和硒的釋放，另一方面膽鹽能增強(qiáng)胰酶的活性。因而在胃腸消化后，砷和硒的生物可給部分更多得以釋放出來[25]。

圖1 大米、魚肉中砷的胃生物可給性、胃腸生物可給性Fig. 1 Gastric and gastrointestinal bioaccessibility of arsenic in rice and fish

圖2 大米、魚肉中硒的胃生物可給性、胃腸生物可給性Fig. 2 Gastric and gastrointestinal bioaccessibility of selenium in rice and fish

表2 大米和魚肉中總砷和總硒的含量及生物可給濃度Table 2 Total contents and bioaccessible concentration of arsenic and selenium in rice and fish

表3 大米和魚肉中砷和硒的每日攝入量(EDI)Table 3 Estimated daily intake (EDI) of arsenic and selenium in rice and fish

2.3 健康有益性/風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

所研究的大米和魚肉中總砷和總硒的每日攝入量如表3所示。

以生物可給的濃度計(jì)算得到的每日砷和硒攝入量均小于以食品中砷和硒的初始濃度計(jì)算得到的值。計(jì)算得到每日通過大米和魚肉攝入的硒為0.274～1.025 μg·kg-1，硒在微量情況下對(duì)人體有利，其推薦攝入量為最高為55 μg·d-1(即成人和小孩分別為1.69和0.92 μg·kg-1·d-1)[1]，因此，仍需通過膳食調(diào)整，使從大米和魚肉攝入的硒來滿足人體需求，尤其對(duì)于小孩來說，應(yīng)該注意硒的適量攝入。大米中無機(jī)砷含量約占45%～78.3%[16]，而魚肉中無機(jī)砷含量約占總含量的5%[38]，通過公式(2)和(3)，計(jì)算得到成人和小孩通過表3中攝入無機(jī)砷的致癌風(fēng)險(xiǎn)分別為1.69×10-5～5.81×10-4和2.13×10-4～7.34×10-4，是可接受或可容忍的風(fēng)險(xiǎn)的0.17～7.3倍。因此，盡管通過大米和3種魚攝入的無機(jī)砷占國際糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)公布的無機(jī)砷的每周暫定耐受量(PTWI)[6](15 μg·kg-1BW，折算成每日最高暫定耐受量為2.1 μg·kg-1BW)的0.5%～35.7%，但是所研究的大米和魚肉中無機(jī)砷的致癌風(fēng)險(xiǎn)較大，尤其是小孩，更易攝入砷產(chǎn)生毒害。

針對(duì)廣州市售的大米和魚肉中砷和硒的生物可給性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，大米和魚肉中86.86%～99.34%和51.95%～75.64%的砷生物可給，76.73%～85.44%和71.48%～79.83%的硒生物可給。并在生物可給濃度的基礎(chǔ)上對(duì)每日攝入量進(jìn)行了計(jì)算。在廣州，成人和小孩每日通過大米和魚肉攝入的硒為0.274～1.025 μg·kg-1，攝入的砷為0.225～1.017 μg·kg-1，但計(jì)算得到成人和小孩攝入無機(jī)砷的致癌風(fēng)險(xiǎn)是可接受或可容忍的風(fēng)險(xiǎn)的0.17～7.3倍，日常生活中需要注意減少砷含量較高的海魚以及無機(jī)砷較高的大米的攝入，尤其是小孩。但本文只單獨(dú)考察了總砷的攝入，無機(jī)砷的百分含量是根據(jù)文獻(xiàn)估算，下一步應(yīng)考察無機(jī)砷的生物可給性，綜合其他食品中砷的生物可給性以及通過水、土壤等環(huán)境介質(zhì)攝入的砷進(jìn)行人體砷暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。