李 欣， 蘆光新， 姚世庭， 黨 寧， 王英成

(1. 青海大學， 青海 西寧 810016； 2. 青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016)

漆酶(Laccase EC 1.10.3.2)是1883年被日本科學家Yoshida發(fā)現(xiàn)[1]，1894年被法國人Bertrand[2]研究并命名的一種酶。漆酶是一種催化中心含有多個銅離子的廣泛存在于植物、動物、微生物及昆蟲中的多酚氧化酶，可氧化木質素、酚類化合物、非酚類化合物等底物，且隨著漆酶的氧化還原電勢越高，可降解的底物范圍越廣[3]。通過一百多年的發(fā)展，漆酶在食品工業(yè)、制漿和造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、土壤的生物修復等領域具有廣泛的應用前景[4]。在服裝行業(yè)、生物傳感器、環(huán)境修復、毒品檢測和清除軍用化學毒劑等方面也有相關的研究報道[5]。

植物產(chǎn)生的漆酶發(fā)現(xiàn)最早，但高等植物產(chǎn)生的漆酶的研究相對較少。目前，已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)漆酶的植物有日本漆樹、歐亞槭樹、擬南芥、水稻、松樹、黃楊、棉花、芒果和香蕉等[6-7]，存在漆酶的動物(昆蟲)有豬、煙草天蛾、綠頭蒼蠅、蚊子及雙翅目的遷移類蝗蟲等[8-10]。微生物漆酶的研究主要以真菌漆酶為主，因其產(chǎn)生的是胞外酶，容易提取，并且其是唯一可以將木質素降解生成二氧化碳和水的多酚氧化酶[11]。動植物產(chǎn)漆酶一般生長周期長，同時還受地理、氣候和季節(jié)等因素的限制，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。微生物生長周期短，繁殖快，且易于提取與純化，微生物產(chǎn)生的漆酶是工業(yè)漆酶的重要來源[12]，備受國內外的科學研究的青睞[13-15]。

由于漆酶巨大的應用價值以及不同物種中漆酶的含量、催化部位的結構和酶學性質差異較大，因此，進行漆酶產(chǎn)生菌的分離篩選一直是漆酶研究的熱點之一。到目前為止，已有從土壤中分離篩選產(chǎn)漆酶真菌的報道[16-19]，但高寒草地土壤中產(chǎn)漆酶菌株的篩選鮮有報道，高寒草地土壤環(huán)境中孕育著豐富的微生物資源，常年持續(xù)的低溫環(huán)境可能會造就其不同于其他環(huán)境的微生物資源，因此在高寒環(huán)境中探索與發(fā)現(xiàn)新的產(chǎn)漆酶真菌具有重要意義。本文選用漆酶作用的8種底物為選擇性培養(yǎng)基，并通過測定漆酶活力，篩選高寒草地土壤中的產(chǎn)漆酶菌株，以期豐富漆酶產(chǎn)生菌的種類，并且為高寒草地土壤微生物產(chǎn)漆酶菌株的篩選研究做初步探究。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的9個真菌菌株1.9，2.1a，310b，2.1c，2.3a，2.4d，10a，3.7c，WB均由本課題組從東祁連山高寒草地土壤中通過稀釋分離法，將土壤樣品母液進行梯度稀釋，選用適當?shù)呐囵B(yǎng)基進行分離、純化和純培養(yǎng)后篩選獲得，保存于4℃冰箱。

東祁連山高寒草地自然概況：實驗區(qū)位于甘肅省天?？h境內，海拔2 700～4 300 m之間。氣候寒冷潮濕，空氣稀薄、太陽直射強。年均溫-0.1℃，1月份均溫-18.3℃，7月份均溫12.7℃；大于0℃年積溫1 380℃。水熱同期，年均降水量416 mm，集中在7-9月份；年蒸發(fā)量1 592 mm，無絕對無霜期，僅分為冷、熱兩季。區(qū)內土層較薄，有機質含量高，微生物資源豐富。

1.2 培養(yǎng)基

菌株活化、保存培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 ml。

產(chǎn)漆酶菌株篩選培養(yǎng)基察氏培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，底物10 g，瓊脂10 g，蒸餾水1 000 ml。

漆酶底物選擇性培養(yǎng)基在察氏培養(yǎng)基的基礎上，分別添加1%的愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)、ABTS(Agreement of Basic Telecommunications Services)、蒽酮(Anthrone)、鄰苯二酚(Catechol)、鄰聯(lián)甲苯胺(o-Tolidine)、鄰甲苯胺(o-Toluidine)、α-萘酚(α-Naphthol)、聯(lián)苯胺(Benzidine)、沒食子酸(Gallic acid)等9種漆酶底物，滅菌備用。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：NaNO32.5 g，KH2PO41 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，MgSO40.3 g，NaCl0.1 g，F(xiàn)eCL30.01 g，蒸餾水1 000 ml，pH自然。滅菌后加入統(tǒng)一直徑的菌餅。

草地植物粉末-液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：草地植物粉末1 g，NaNO32.5 g，KH2PO41 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，MgSO40.3 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCL30.01 g，蒸餾水1 000 ml。滅菌后加入統(tǒng)一直徑的菌餅。

1.3 研究方法

1.3.1產(chǎn)漆酶真菌的初步篩選 將活化的菌株接種于分別以愈創(chuàng)木酚、ABTS、蒽酮、鄰苯二酚、鄰聯(lián)甲苯胺、鄰甲苯胺、α-萘酚、聯(lián)苯胺、沒食子酸為底物的察氏培養(yǎng)基上，以25℃培養(yǎng)，定時觀察菌落生長和菌落周圍顏色深淺變化情況。

選出能產(chǎn)生褐色氧化帶的菌株，25℃培養(yǎng)，每天定時觀察菌落形態(tài)的同時，測量菌絲圈、變色圈直徑，記錄變色圈顏色深淺，以判斷漆酶生產(chǎn)菌株。

1.3.2粗酶液的制備及漆酶活力測定 將制備好的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基置于25℃、180 r·min-1的搖床發(fā)酵。粗酶液制備好后按照王劍鋒等[24]方法進行測定，一個酶活單位(IU)定義為1 min內氧化1 μmol底物所需要的酶量。

1.3.3產(chǎn)漆酶菌株的DNA-ITS分子鑒定 將9株菌株的rDNA-ITS序列測定結果與GenBank中已登錄的序列進行Blast比對，使用MEGA7軟件中的Neighbor-Joining程序構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

將不同條件下各處理中酶活力換算成酶活力相對值，所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel錄入并作圖，采用DPS 6.55進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶菌株的DNA-ITS分子鑒定結果

將9株菌株菌株的5.8SrDNA-ITS序列測定結果與GenBank中已登錄的序列進行Blast比對，比對結果如表1所示；使用MEGA7軟件中的Neighbor-Joining程序構建系統(tǒng)進化樹，如圖1所示。

2.2 供試菌株在不同底物選擇性培養(yǎng)基上的顯色情況

由表2可以看出，在愈創(chuàng)木酚選擇性培養(yǎng)基上接種后，菌株1.9，2.1a，310b，2.1c，2.3a，2.4d周圍出現(xiàn)氧化帶；在蒽酮選擇性培養(yǎng)基上接種后，菌株1.9，2.1a，310b，2.1c，2.3a，2.4d，10a周圍出現(xiàn)氧化帶；在鄰苯二酚選擇性培養(yǎng)基上接種后，只有菌株2.4d周圍出現(xiàn)氧化帶；在鄰聯(lián)甲苯胺選擇性培養(yǎng)基上接種后，菌株1.9，2.1a，310b，2.1c，2.3a，2.4d，10a，WB周圍出現(xiàn)氧化帶；在鄰甲苯胺選擇性培養(yǎng)基上接種后，只有菌株2.3a，2.4d周圍出現(xiàn)氧化帶；在1-萘酚選擇性培養(yǎng)基上接種后，只有菌株1.9周圍出現(xiàn)氧化帶；在聯(lián)苯胺選擇性培養(yǎng)基上接種后，菌株1.9，2.1a，310b，2.1c，2.3a，2.4d，10a周圍出現(xiàn)氧化帶；在沒食子酸選擇性培養(yǎng)基上接種后，所有菌株均無氧化帶出現(xiàn)。

表1 菌株鑒定結果及NCBI的注冊號Table1 Identification results of strains and registration number of NCBI

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 phylogenetic tree

各菌株在不同底物培養(yǎng)基上的氧化帶如圖2～圖8所示。菌株在愈創(chuàng)木酚、蒽酮、鄰甲苯胺和鄰苯二酚為底物的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)紅褐色氧化帶，培養(yǎng)基呈半透明狀。菌株在聯(lián)苯胺、α-萘酚為底物的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)紫黑色氧化帶，培養(yǎng)基呈不透明狀。在鄰聯(lián)甲苯胺為底物的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黑褐色氧化帶，培養(yǎng)基呈不透明狀。氧化帶和培養(yǎng)基因底物不同而呈現(xiàn)不同顏色。

表2 供試菌株在不同底物選擇性培養(yǎng)基上的顯色情況Table 2 Color development of test strains on different substrate selective media

注：“√”表示能夠產(chǎn)生氧化帶

Note:“√” means that it can produce an oxidized zone

圖2 菌株在愈創(chuàng)木酚底物培養(yǎng)基上的顯色情況Fig.2 Coloration of strain on wood-induced phenolic substrate medium

圖3 菌株在聯(lián)苯胺底物培養(yǎng)基上的顯色情況Fig.3 Coloration of strains on bibenzidine substrate medium

圖4 菌株在蒽酮底物培養(yǎng)基上的顯色情況Fig.4 Coloration of strain on Anthrone substrate medium

圖5 菌株在鄰甲苯胺底物培養(yǎng)基上的顯色情況Fig.5 Coloration of strain on o-toluidine substrate medium

圖6 菌株在鄰苯二酚底物培養(yǎng)基上的顯色情況Fig.6 Coloration of strain on catechol substrate medium

圖7 菌株在α-萘酚底物培養(yǎng)基上的顯色情況Fig.7 Coloration of strain on α-naphthol substrate medium

圖8 菌株在鄰聯(lián)甲苯胺底物培養(yǎng)基上的顯色情況Fig.8 Coloration of strain on ortho-benzidine substrate medium

2.3 供試菌株在底物選擇性培養(yǎng)基上出現(xiàn)氧化帶的時序

由表3可以看出，菌株1.9和菌株2.3a可氧化底物較少，菌株周圍出現(xiàn)氧化帶時間較長；菌株2.1a、310b、2.3a、2.4d可氧化底物較多，菌株周圍出現(xiàn)氧化帶時間較快，接菌24 h后菌株周圍基本都已出現(xiàn)氧化帶；菌株10a在接菌24 h后，只有在以鄰聯(lián)甲苯胺和聯(lián)苯胺為底物的培養(yǎng)基上出現(xiàn)氧化帶，接菌72 h后，在蒽酮為底物的培養(yǎng)基上出現(xiàn)氧化帶，氧化帶出現(xiàn)時間慢。菌株WB在接菌96 h后，只有在以鄰聯(lián)甲苯胺為底物的培養(yǎng)基上菌株周圍出現(xiàn)氧化帶，在其他7種底物培養(yǎng)基上均無氧化帶出現(xiàn)。菌株3.7c在8種底物培養(yǎng)基上接菌后，無任何氧化帶出現(xiàn)。

表3 供試菌株在不同底物選擇性培養(yǎng)基上出現(xiàn)氧化帶的時序Table 3 Timing of the oxidized bands on the different substrate selective medium of the tested strains

注：表中“+”表示產(chǎn)生氧化帶

Note:"+" in the
Table indicates the occurrence of an oxide band

2.4 供試菌株在底物選擇性培養(yǎng)基上的生長情況及氧化帶大小

將9種菌株分別接在8種不同底物選擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d后，菌株2.1a，310b，2.1c，2.3a，2.4d生長狀況較好，氧化帶直徑較大，菌株直徑也較大。菌株1.9能產(chǎn)生氧化帶底物較多，但氧化帶出現(xiàn)時間晚，氧化帶直徑小，不是產(chǎn)漆酶優(yōu)勢菌株。菌株10a在蒽酮為底物的培養(yǎng)基上生長速度快，菌株直徑大，但氧化帶顏色淺，不是產(chǎn)漆酶優(yōu)勢菌株。

表4 供試菌株在不同底物選擇性培養(yǎng)基上的生長情況Table 4 Growth of test strains on different substrate selective medium

注：表中A表示氧化帶直徑/cm，B表示菌落直徑/cm。列出的氧化帶直徑一欄中，前面的數(shù)字表示氧化帶直徑，括號中的“+”表示顏色的深淺程度，“-”表示沒有產(chǎn)生氧化帶

Note:In the
Table,A represents the diameter of the oxidation zone/cm,and B represents the diameter of the colony/cm. In the column of diameter of the listed oxidation zone,the front number indicates the diameter of the oxidation zone,the "+" in parentheses indicates the degree of lightness,and the "-" indicates that no oxidation zone is produced

2.5 產(chǎn)漆酶菌株的復選

圖9可以看出，菌株在液體搖瓶發(fā)酵后，以ABTS為氧化產(chǎn)物測定吸光值，結果發(fā)現(xiàn)菌株310b的吸光值也同樣明顯高于其他菌株，差異極顯著(P<0.01),這說明菌株310b產(chǎn)漆酶活性最高。

圖9 菌株在草地植物粉末誘導下的吸光值

3 討論

漆酶作為一種氧化酶，初步統(tǒng)計它催化氧化不同類型的底物已達250個[20]。按底物結構可歸納為六類[21]:(1)酚及其衍生物；(2)芳胺及其衍生物；(3)羧酸及其衍生物；(4)甾體激素和生物色素；(5)金屬有機化合物；(6)其他非酚底物。但是目前常見漆酶底物有多種單體或多聚體酚類、苯胺及一些雜環(huán)化合物[22]，測定漆酶活力普遍使用的底物為ABTS(2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙硝基并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽)、DMP(鄰苯二甲酸二甲脂)和愈創(chuàng)木酚，但由于漆酶對不同底物的氧化速率的不同而呈現(xiàn)多種漆酶活力的表述方式，使得各研究中漆酶的活力不易做比較。本實驗中因考慮到實驗成本和實驗效果因素，故選用愈創(chuàng)木酚、蒽酮、鄰苯二酚、鄰聯(lián)甲苯胺、鄰甲苯胺、α-萘酚、聯(lián)苯胺、沒食子酸8種底物對9株不同產(chǎn)漆酶真菌菌株進行了篩選比較。

根據(jù)漆酶催化氧化還原反應產(chǎn)生的氧化帶時序、氧化帶直徑平均值及其顏色深淺程度，以及菌體的生長和菌落大小對不同產(chǎn)漆酶菌株和不同誘導產(chǎn)漆酶底物做一個篩選分析。實驗中發(fā)現(xiàn)，9株菌株在8種底物上的生長狀況各不相同。在以沒食子酸為底物的選擇培養(yǎng)基上，9株菌株均不產(chǎn)生氧化帶，菌株顏色發(fā)黑，推測沒食子酸對菌株生長具有抑制作用。菌株在不同培養(yǎng)基上的顯色反應有差別，可能是培養(yǎng)過程中8種底物對不同菌株漆酶生物合成的誘導作用不同，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生除了與菌株所合成漆酶的產(chǎn)量、活力和類型有關外，可能還與不同菌株所產(chǎn)的漆酶對不同底物的催化專一性差別有關。在蒽酮和鄰聯(lián)甲苯胺為底物的選擇性培養(yǎng)基上菌絲生長快，菌落直徑大，產(chǎn)生變色圈快，變色圈的顏色深，推測這兩種底物與菌株產(chǎn)生漆酶親和性高。菌株在愈創(chuàng)木酚和聯(lián)苯胺為底物的選擇性培養(yǎng)基上菌絲生長速度、菌落直徑、變色圈生長速度以及變色圈的顏色都次于蒽酮和聯(lián)苯甲苯胺。菌株在鄰甲苯胺和鄰苯二酚為底物的選擇性培養(yǎng)基上菌絲生長慢，菌落直徑無變化，產(chǎn)生的變色圈直徑小，顏色淺，這與蘆光新等[23]對高寒草地土壤三色小皮傘菌產(chǎn)漆酶特性的研究中的結果稍有偏差，但結果呈現(xiàn)相同規(guī)律，可能的原因是蘆光新在底物篩選時采用底物-PDA培養(yǎng)基，營養(yǎng)豐富，利于菌絲生長，而本文中采用察氏培養(yǎng)基。另外，不同菌株在8種平板培養(yǎng)基上的生長速度不同，因此漆酶催化氧化還原反應產(chǎn)生的變色圈直徑與菌落大小沒有必然的相關性。

菌株1.9可顯色底物有5個，分別為愈創(chuàng)木酚、蒽酮、鄰聯(lián)甲苯胺、聯(lián)苯胺和α-萘酚，但是氧化帶出現(xiàn)時間都晚，可能是菌株1.9與底物親和力差，產(chǎn)生漆酶的能力弱或者產(chǎn)生的漆酶活力低。菌株2.4d在除了α-萘酚和沒食子酸以外的底物上均能產(chǎn)生氧化帶，菌絲生長速度快，氧化帶直徑大、顏色深，但在以ABTS為底物測酶活時，酶活性低。菌株2.1a、2.3a、310b、2.1c在各底物培養(yǎng)基上菌絲生長狀況和氧化帶出現(xiàn)時間相差不多，但結果顯示菌株310b產(chǎn)生的漆酶活力高。大多數(shù)菌株在同種培養(yǎng)基的不同平行平板上顯示的顏色與直徑大小比較接近，但不同菌株之間顏色深淺有明顯的差別，同一菌株在不同平板上的顯色反應也稍有差別，顯色圈相對大小不完全相同，但大多數(shù)菌株呈現(xiàn)出了較好的一致性，說明選擇平板的穩(wěn)定性和高度可重復性。蒽酮、鄰聯(lián)甲苯胺、聯(lián)苯胺和愈創(chuàng)木酚對漆酶的產(chǎn)生可能具有一定的誘導作用，但是，也有少部分菌株的顏色深淺不一致。這些現(xiàn)象的產(chǎn)生除了與菌株所合成漆酶的產(chǎn)量、活力和類型有關外，可能還與不同菌株所產(chǎn)的漆酶對于不同底物的催化專一性差別有關。

愈創(chuàng)木酚既是漆酶的氧化底物又是漆酶生物合成的誘導劑，α-萘酚對于漆酶的產(chǎn)生具有一定促進作用[24]，孫姣[25]利用漆酶能夠氧化愈創(chuàng)木酚為紅褐色的顯色反應，在鑒別培養(yǎng)基篩選到產(chǎn)漆酶的三株木豆內生真菌菌株。漆酶常用于染料脫色，本實驗所選底物愈創(chuàng)木酚、鄰甲苯胺、蒽酮、鄰聯(lián)甲苯胺、聯(lián)苯胺及沒食子酸或為染料、或為染料制劑，Prasad等[26]研究了來自Pycnoporuscinnabarinus的漆酶和苯胺類有毒工業(yè)染料的相互作用；Cambria等[27]研究比較了 2，5-二甲基苯胺抑制Rigidoporuslignosus漆酶和Trametesversicolor漆酶的分子機制；任大軍等[28]研究以漆酶結合ABTS的介體系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)對蒽的降解率達到 90% 以上。馬利[29]發(fā)現(xiàn)漆酶對活性藍4與雷瑪唑亮藍能達到不錯的脫色效果。Majcherczyk等[30]以云芝菌所產(chǎn)漆酶對 14 種多環(huán)芳烴降解進行測試，發(fā)現(xiàn)其中包括苊、熒蒽、芘及苯并[a]蒽等的降解率僅約 10%，漆酶底物種類繁多，但也存在許多尚未解決的問題[31]，如漆酶的穩(wěn)定性不足、氧化還原電勢低等，真正成熟應用降解的底物屈指可數(shù)。而本文中出現(xiàn)的不同菌株在不同底物之間出現(xiàn)差異的原因除了底物的結構和功能的不同外，其他原因還需進一步研究。

4 結論

將篩選出的9株菌株經(jīng)鑒定結果為菌株1.9為Unculturedfungusclone.、2.1a為Scytalidium、310b為Marasmiustricolor、2.1c為Saccharicola、2.3a為fungalsp、2.4d為Saccharicola.、10a為Marasmiusrotalis、3.7c為Alternaria. WB為Verticilliumlongisporum。根據(jù)菌株在愈創(chuàng)木酚、蒽酮、鄰苯二酚、鄰聯(lián)甲苯胺、鄰甲苯胺、α-萘酚、聯(lián)苯胺、沒食子酸為底物的選擇性培養(yǎng)基上的生長情況、菌落大小、漆酶催化氧化還原反應產(chǎn)生的變色圈直徑大小及其顏色深淺程度，進行產(chǎn)漆酶真菌初篩，采用液體產(chǎn)酶發(fā)酵法選用ABTS為底物測定漆酶活力進行復篩，結果表明：除菌株3.7c以外，其余8株菌株在以愈創(chuàng)木酚、蒽酮、鄰聯(lián)甲苯胺、聯(lián)苯胺為底物的培養(yǎng)基上基本都產(chǎn)生氧化帶，在沒食子酸底物培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生氧化帶；菌株1.9，2.1a，310b，2.4d，10a，2.1c，2.3a均具有產(chǎn)漆酶活力，其中菌株310b具有較強產(chǎn)漆酶活力。