馮玲

摘要：本實驗研究了透明質(zhì)酸鈉溶液和糜蛋白酶溶液相互作用的共振瑞利散射光譜，其最大散射峰為300nm，RRS的強度在一定濃度范圍內(nèi)與透明質(zhì)酸鈉溶液濃度呈良好的線性關(guān)系，本文同時討論了實驗適宜的反應條件以及共存物質(zhì)對測定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示該方法具有較好的靈敏度，且有較好選擇性，從而建立一種測定透明質(zhì)酸鈉的新方法。該方法測定滴眼液中透明質(zhì)酸鈉的含量，效果較好。

關(guān)鍵詞：糜蛋白酶；共振瑞利散射；透明質(zhì)酸鈉

透明質(zhì)酸鈉（Sodium hyaluronate，以下簡稱SH）可從雞冠中提取或通過乳酸球菌發(fā)酵獲得，SH是一種白色粉末狀固體，有時也呈纖維狀，具有較好的保濕性，能溶于水，不溶于乙醚、丙酮和乙醇等有機溶劑，無臭味，干燥時，氮含量為2.8%～4.0%，葡糖醛酸含量為37.0%～51.0%。是一種鏈狀的天然高分子多糖類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如下：

以前在測定透明質(zhì)酸鈉的方法上都有各自的優(yōu)點和不足，本實驗擬采用共振瑞利散射法對透明質(zhì)酸進行測定，來建立一種更為高效、準確的檢測方法。共振瑞利散射有如下的優(yōu)點：①對稀溶液可進行測定，且靈敏度較高；②可操作性強，同時對RRS光譜的特征亦可進行研究。因其有較高的信號水平，可采用普通熒光光度計的普通光源作為發(fā)射光源，使普通光源通過單色器，形成波長連續(xù)的入射光，再經(jīng)由普通熒光分光光度計同步掃描即可得到清晰完整的RRS光譜。整個實驗過程中使用普通的熒光分光光度計即可得到測定物質(zhì)的RRS光譜，由于使用儀器的廉價，對該技術(shù)的普及使用也更加容易。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

日立F-2700型熒光分光光度計， 測定參數(shù)：狹縫5 nm；PHS-3C型精密PH計，校正溶液PH值。

1.2 實驗試劑

配制0.4 mg/mL的透明質(zhì)酸鈉溶液。糜蛋白酶溶液：采用100 μg/mL的樣品。BR緩沖溶液：將0.04 mol/L H3PO4，H3BO3和CH3COOH混合一定比例的0.2 mol/L NaOH溶液，得到不同PH值的BR緩沖溶液，通過酸度計得出其PH值。該實驗使用的其余試劑濃度均達到分析純標準，使用二次蒸餾水作為實驗用水。

1.3 實驗方法

將PH=3.3的BR緩沖溶液1.0 mL、Chy溶液0.6 mL以及一定量的SH標準溶液加入10 mL的比色管中混合均勻，稀釋至刻度后再搖勻。靜置10 min后，用熒光分光光度計進行同步掃描（λex=λem）同時記錄以各自最大散射波長處測定樣品的共振瑞利散射光譜IRRS和試劑空白散射強度的共振瑞利散射光譜I0RRS，?IRRS=IRRS-I0RRS。

2 結(jié)果與討論

光譜特征

RRS光譜

以△λ=0 nm分別掃描SH溶液、Chy溶液以及SH-Chy體系溶液，得RRS光譜圖。通過觀察并分析光譜圖可得：單獨的SH溶液和Chy溶液其共振瑞利散射強度都很微弱，但當兩者混合后，相互作用形成復合物時，共振瑞利散射強度明顯增強，并在300 nm處產(chǎn)生一個清晰的散射峰。

通過研究不同濃度的SH溶液對Chy-SH體系RRS強度的影響，得到RRS光譜。從光譜圖可知：當SH concentration的濃度在0～1.0 μg/mL范圍內(nèi)遞增時，Chy-SH體系的RRS強度在300 nm處依次增強，呈良好的線性關(guān)系。

適宜的反應條件

（1）酸度的影響。分別試驗了BR、HAc-NaAc等緩沖溶液對SH-Chy體系的影響，結(jié)果顯示BR緩沖液對體系的測定最佳，進一步優(yōu)化BR緩沖液在不同PH值對該體系的影響。通過進行數(shù)據(jù)分析可知，當溶液PH在2.8～4.8時該體系的共振瑞利散射光譜的差值最大，本實驗選取PH=3.3的BR緩沖液1.0 mL進行實驗。

（2）糜蛋白酶濃度的影響。從結(jié)果可以看出Chy與SH反應在Chy濃度5.0～15 μg/mL時，Chy-SH體系的散射強度達到最大，以下實驗選用Chy濃度為6.0 μg/mL。

反應時間及穩(wěn)定性

在上述的實驗條件和室溫下，考察了時間及該體系的穩(wěn)定性，實驗結(jié)果顯示10 min內(nèi)Chy溶液與SH溶液可完全反應，且在1h內(nèi)其DIRRS的值較為穩(wěn)定，所以當實驗反應10 min后再進行測定。

標準曲線

選擇最佳實驗反應條件，分別將不同濃度的SH溶液與Chy溶液進行混合，并在其最大波長處測定RRS的強度，通過使用該體系散射增強后的ΔIRRS值進行繪制透明質(zhì)酸鈉濃度標準曲線。實驗結(jié)果表明該方法對透明質(zhì)酸鈉的測定靈敏度較高、檢出限較好，其檢出限為4.33 ng/mL。

方法的選擇性

實驗研究了共存金屬離子、無機酸根、糖類、氨基酸等對該體系的影響。實驗結(jié)果表明以上物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)對該體系不造成影響，該方法具有良好的選擇性。

3 分析應用

在10 mL比色管中加入稀釋后濃度為1.0 mL（0.01 mg/mL）的透明質(zhì)酸鈉滴眼液，在最佳條件下對其進行測定，再向其中加入標準的透明質(zhì)酸鈉溶液來檢驗該方法的回收率。分析實驗數(shù)據(jù)從而得出該方法具有較好的準確度和精密度。

4 結(jié)論

本實驗考察了透明質(zhì)酸鈉溶液與糜蛋白酶溶液混合體系的共振瑞利散射光譜，建立了一種測定透明質(zhì)酸鈉的新方法，該方法應用于滴眼液中透明質(zhì)酸鈉含量的測定結(jié)果較好，令人滿意。

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（作者單位：四川省南充市高坪第七小學江東校區(qū)）