呂 輝，劉 霞，龔 維，劉 新，姚旭霞

(中國(guó)兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，山東濟(jì)南 250031)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是葡萄球菌屬(Staphylococcus)的典型代表之一，菌體直徑約為0．8μm，小球形，常堆聚成葡萄串狀，革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽孢和莢膜［1］，別稱(chēng)“嗜肉菌”，是人類(lèi)的一種重要的病原菌［2］。它能夠產(chǎn)生腸毒素，導(dǎo)致腹瀉等腸道疾病，也可引起局部或者全身化膿感染［3］，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中，空氣、水、土壤、灰塵甚至是人的皮膚表面都可以找到。因此，在生物、醫(yī)藥和食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌的定性實(shí)驗(yàn)都是重要的檢查項(xiàng)目。

在食品檢測(cè)中，對(duì)于金黃色葡萄球菌的定性實(shí)驗(yàn)，通常采用GB 4789．10－2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的第一法［4］(簡(jiǎn)稱(chēng) 標(biāo)準(zhǔn)方法)進(jìn)行檢驗(yàn)，主要是通過(guò)驗(yàn)證金黃色葡萄球菌在不同平板上的菌落狀態(tài)和某些生理活動(dòng)產(chǎn)生的生化反應(yīng)來(lái)判定是否有金黃色葡萄球菌的存在。隨著微生物檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，一些大型微生物自動(dòng)鑒定儀能夠通過(guò)集成某些生化反應(yīng)，自動(dòng)鑒定微生物的種類(lèi)，使得微生物的鑒定更加高效便捷，在日常檢驗(yàn)中的應(yīng)用逐步廣泛起來(lái)，因此也可以作為金黃色葡萄球菌定性檢測(cè)的重要方法。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1．1 標(biāo)準(zhǔn)方法

根據(jù)GB 4789．10－2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的第一法，采用觀察菌落在不同平板上的形態(tài)和血漿凝血酶實(shí)驗(yàn)共同判定是否為金黃色葡萄球菌。

1．1．1 BP 平板

金黃色葡萄球菌在BP平板上，菌落為棕黑色或黑色，周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)透明環(huán)。這是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌可以還原亞碲酸鉀中的碲元素，此時(shí)顏色變?yōu)樽睾谏蚝谏?。同時(shí)，金黃色葡萄球菌還可以產(chǎn)生卵磷脂酶，溶解培養(yǎng)基中的卵黃，從而形成透明環(huán)。

1．1．2 血瓊脂平板

金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上，菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)透明溶血環(huán)，是因?yàn)橹虏⌒缘慕瘘S色葡萄球菌能夠產(chǎn)生溶血毒素。

1．1．3 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

金黃色葡萄球菌能夠使新鮮的兔血漿凝固，因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌能產(chǎn)生凝血漿酶，使血液凝固。

1．2 微生物自動(dòng)鑒定儀法

梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)是一種高度集成化的儀器，需要與微生物鑒定卡共同使用，該卡片還有多個(gè)小格，添加了不同的化學(xué)試劑，菌液通過(guò)儀器被壓入卡片中，進(jìn)入各個(gè)小格，與其中試劑發(fā)生生化反應(yīng)，在儀器的孵育箱中孵育一定時(shí)間，儀器每隔15 min自動(dòng)掃描一次，將每個(gè)小格內(nèi)的顏色變化記錄下來(lái)，并綜合分析，鑒定出不同的菌種。

2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

2．1 標(biāo)準(zhǔn)方法

生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;百級(jí)超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;立式滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;血瓊脂平板，北京路橋技術(shù)股份有限公司;Baird－Parker瓊脂平板，北京路橋技術(shù)股份有限公司;兔血漿，北京路橋技術(shù)股份有限公司;革蘭氏染色液試劑盒，北京路橋技術(shù)股份有限公司。

2．2 微生物自動(dòng)鑒定儀法

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，梅里埃(上海)生物制品有限公司;4．5%生理鹽水，梅里埃(上海)生物制品有限公司;電子濁度儀，梅里埃(上海)生物制品有限公司;革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡，梅里埃(上海)生物制品有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3．1 標(biāo)準(zhǔn)方法

(1)預(yù)先配置225 mL17．5%氯化鈉肉湯溶液，加入到500 mL錐形瓶中，滅菌并涼至適宜溫度。量取樣品A 25 mL至錐形瓶中，于36℃ ±1℃搖床培養(yǎng)18～24 h后觀察。

(3)將上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種到B－P平板上，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24 h或45～48 h后觀察菌落形態(tài);

將上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種到血瓊脂平板上，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24h后觀察菌落形態(tài)。

(4)挑取B－P平板或血瓊脂平板上的可疑菌落1個(gè)或以上，采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，制作玻片進(jìn)行鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

(5)挑取B－P平板或血瓊脂平板上的可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5 mLBHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24 h。

(6)取新鮮配置兔血漿0．5 mL，放入小試管，加入BHI培養(yǎng)物0．2～0．3 mL，震蕩搖勻，置36℃ ±1℃溫箱或水浴箱中，每半小時(shí)觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固(將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽(yáng)性結(jié)果。

3．2 微生物自動(dòng)鑒定儀法［5］

(1)將樣品A接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24 h，采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，制作玻片進(jìn)行鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)，如有疑似的葡萄球菌，則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

(2)在小試管中加入3 mL滅菌的4．5%生理鹽水，挑取可疑菌落，加入試管中，用電子濁度儀測(cè)試濁度在0．5左右。

(3)將試管放入卡架左側(cè)，GP卡放入右側(cè)，試GP卡藍(lán)色管插入菌液中，放入儀器，進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)完成后，在電腦中查看鑒定結(jié)果。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4．1 標(biāo)準(zhǔn)方法

4．1．1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板

如圖1a，菌落較小，圓形濕潤(rùn)，具有金黃色光澤。

4．1．2 7．5%氯化鈉肉湯溶液

圖1d為未接種前7．5%氯化鈉肉湯溶液，圖1e為接種后培養(yǎng)24 h的7．5%氯化鈉肉湯溶液，可見(jiàn)明顯渾濁。

4．1．3 B －P 平板結(jié)果

如圖1b，菌落為棕黑色，周?chē)型该鳝h(huán)。

4．1．4 血瓊脂平板結(jié)果

如圖1c，菌落較大，有透明溶血環(huán)。

4．1．5 革蘭氏染色結(jié)果

如圖1f，革蘭氏染色陽(yáng)性，藍(lán)紫色，球菌。

4．1．6 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1 g，兔血漿發(fā)生凝集反應(yīng)，證明有凝血漿酶產(chǎn)生。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4．2 微生物自動(dòng)鑒定儀法

梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果:金黃色葡萄球菌，置信度:99%，耗時(shí):4．25 h。

5 結(jié)論與展望

由各個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確定樣品A中確實(shí)存在金黃色葡萄球菌，且標(biāo)準(zhǔn)方法和微生物自動(dòng)鑒定儀法均可以檢測(cè)出正確結(jié)果。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)需要分別進(jìn)行6項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，耗時(shí)4～5 d，而使用微生物自動(dòng)鑒定儀VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅需4．25 h。由此可見(jiàn)，微生物自動(dòng)鑒定儀比標(biāo)準(zhǔn)方法更加快速，且節(jié)省人工。并且VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的最大載荷為30張卡，即一次最多可以檢測(cè)30個(gè)樣品，一次鑒定過(guò)程約6～8 h，效率更高。

在目前的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)于金黃色葡萄球菌的定性試驗(yàn)尚無(wú)微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定方法的介紹，隨著檢測(cè)科技的更新，微生物自動(dòng)鑒定儀在生物、醫(yī)藥、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)等方向的應(yīng)用會(huì)更加廣范。