趙名君，李俊南，曹 森，孫總政，高 天，杜 文,，孫景寬，于 江，伊夢(mèng)潔，陳萬(wàn)浩

(1.濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256600；2.濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

葉底珠(Securinegasuffruticosa(Pall.) Rehd)為大戟科葉底珠屬植物，別名一葉荻、狗杏條、黃恨子、懶漢菜等[1]。葉底珠高莖叢生，多分枝，是能夠在干旱荒漠區(qū)生長(zhǎng)，耐干旱貧瘠的一種重要固沙灌木[2]。葉底珠富含一葉萩型生物堿類化合物、黃酮、蘆丁、鞣質(zhì)、酚類化合物及多種氨基酸等有效化學(xué)成分[3-4]。葉底珠通常根部入藥，具有活血舒筋、健脾益腎、祛風(fēng)活血等功效，用于治療風(fēng)濕腰痛、四肢麻木和小兒疳積等疾病[2，5]，對(duì)神經(jīng)衰弱、面部神經(jīng)麻痹、小兒麻痹后遺癥、眩暈、耳聾、神經(jīng)衰弱、嗜睡癥、陽(yáng)痿、急性肝損傷等疾病也有一定的療效[4，6-10]。葉底珠具有很好的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用價(jià)值，市場(chǎng)的需求量高。為了保護(hù)野生資源，尋找能產(chǎn)生葉底珠活性物質(zhì)和藥理活性相似的內(nèi)生真菌是一個(gè)值得研究的方法。

植物內(nèi)生真菌是指存在于植物體內(nèi)，但不引起植物病害的一類真菌[11]。內(nèi)生真菌與宿主植物具有非常復(fù)雜的關(guān)系，它能夠產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)和激素，也能夠產(chǎn)生幫助宿主抵御病害的物質(zhì)，還能夠產(chǎn)生眾多的藥用活性組分以及多種具有生物活性的產(chǎn)物等[11-12]。內(nèi)生真菌分布廣泛，種類豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)真菌的新型天然產(chǎn)物約一半來(lái)源于內(nèi)生真菌[13]，其中包括大量的具有抗菌活性的天然化合物[14-15]。目前，對(duì)葉底珠內(nèi)生真菌抗真菌細(xì)菌活性的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組采集了葉底珠，對(duì)其根部、莖部和葉部的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離純化，此外利用8種病原菌為指示劑，對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了初步研究，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段，對(duì)具有抑菌活性的內(nèi)生真菌的分類地位進(jìn)行了鑒定，為進(jìn)一步尋找抗菌活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葉底珠Securinegasuffruticosa(Pall.) Rehd 健康植株采自黃河三角洲貝殼堤島，經(jīng)濱州學(xué)院夏江寶教授鑒定。供試病原菌：金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus，大腸埃希菌Escherichiacoli， 銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa，糞腸球菌Enterococcusfaecalis，白色念珠菌Candidaalbicans，小麥赤霉病菌Fusariumgraminerum，立枯絲核菌Rhizoctoniasolani，辣椒炭疽病菌Colletotrichumcapsici由濱州學(xué)院生物制藥教研室和貴州大學(xué)生化營(yíng)養(yǎng)研究所提供。DNA 提取試劑盒、2×Pfu PCR 預(yù)混液、DNA-Marker、引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3') 購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 內(nèi)生真菌分離與純化

采集新鮮健康的葉底珠完整植株，用無(wú)菌水沖洗干凈，置于濾紙上自然風(fēng)干，去腐葉。分別將葉底珠的根、莖、葉等切成約0.5 cm的小段，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中。按下列程序進(jìn)行表面消毒[15]：75%乙醇漂洗約3 min，無(wú)菌水沖洗5次，0.1%升汞消毒約3 min，無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌濾紙吸取多余水分，無(wú)菌刀片將材料切成0.2 cm×0.2 cm 的小塊段。將上述組織塊分別置于加有青霉素和鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中，每皿3塊，26 ℃恒溫培養(yǎng)，同時(shí)將上述經(jīng)表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于PDA 培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)，檢查表面消毒是否徹底。培養(yǎng)3～10 d后及時(shí)采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌絲或菌落移種到新鮮PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，純化后轉(zhuǎn)接到斜面上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

挑取經(jīng)活化的內(nèi)生真菌菌絲或孢子接種于PDA 液體培養(yǎng)基中，于26 ℃、120 r/min 培養(yǎng)7 d；5 000 r/min 離心20 min，收集菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體先經(jīng)超聲破碎，再把經(jīng)95%乙醇浸提24 h后減壓濃縮成醇浸膏，用適量無(wú)菌水45 ℃溫浸，充分混勻制成菌體待測(cè)溶液。發(fā)酵液未經(jīng)濃縮直接進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。采用濾紙片擴(kuò)散法：將約 1×108cfu/mL指示細(xì)菌菌液(或真菌的孢子)涂布于牛肉膏蛋白胨平板(或PDA培養(yǎng)基，白色念珠菌采用沙氏培養(yǎng)基)，在適當(dāng)位置貼上己滅菌的濾紙片(Φ=6 mm)，然后分別吸取發(fā)酵液和菌體待測(cè)溶液20 μL 置于濾紙片上，無(wú)菌水做對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)16～24 h，白色念珠菌在28 ℃培養(yǎng)36～48 h，其他真菌在28 ℃恒溫培養(yǎng)96～108h， 觀察菌體生長(zhǎng)情況，并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

形態(tài)鑒定:用接種針挑取少量菌絲點(diǎn)植在查氏培養(yǎng)基的平板的中心位置，然后于28 ℃ 培養(yǎng)7或14 d進(jìn)行觀察。觀察菌落顏色、大小、菌落紋飾、質(zhì)地、邊緣;分生孢子形態(tài)及大小[16]。

分子鑒定：取內(nèi)生真菌發(fā)酵后離心，取菌絲冷凍干燥。取100mg 菌絲于2 mL EP 管內(nèi)按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書的步驟采用CTAB 法提取內(nèi)生真菌DNA。按照25μL體系，加入12.5μL 2×Pfu PCR Mix，0.5μL ITS1，0.5μL ITS4，1.5μL DNA， 10μL超純水。以ITS1 和ITS4 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，95 ℃、5 min，95℃、45 s，52 ℃、30 s，72 ℃、3 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃、15 min 擴(kuò)增ITS1-5.8S rDNA-ITS2 序列。對(duì)PCR 反應(yīng)產(chǎn)物利用1%的凝膠于120 V 電泳30 min，根據(jù)Marker 判斷是否存在400～800 bp 大小片段。對(duì)于成功擴(kuò)增目的片段的樣品送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行電泳切膠純化測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，搜索同源序列。盡量選取有代表性菌株序列作進(jìn)一步的分析。首先采用Clustal X 1.81 將序列對(duì)齊，利用MEGA 5.2 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并以自展法進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)1 000次，構(gòu)建鄰接樹(shù)。將菌株D11和G11的ITS 序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為 MG548565，MG548557。

采用分離率(isolation rate，IR)定量描述葉底珠內(nèi)生真菌各菌株在葉底珠組織中的豐富度、分布偏好性、組成結(jié)構(gòu)。分離率是分離獲得的菌株數(shù)與分離的組織塊數(shù)的比率，以百分率表示[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉底珠內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)

采用組織塊法從3株葉底珠的根、莖和葉中共分離得到21、12、8株內(nèi)生真菌(表1)，分離率分別為58.33%、48.00%、47.13%，平均分離率為47.98%?？梢?jiàn)葉底珠根部?jī)?nèi)生真菌的數(shù)量明顯多于葉部?jī)?nèi)生真菌，表明內(nèi)生真菌的分布具有組織偏好性。此外，空白對(duì)照培養(yǎng)基上未長(zhǎng)出菌落，說(shuō)明無(wú)環(huán)境污染，并且接觸表面消毒后材料表面的培養(yǎng)基上也無(wú)菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明消毒完全，表明所得菌株為來(lái)自植物體內(nèi)真菌。

表1 葉底珠的根莖葉組織內(nèi)生真菌分離菌株數(shù)和分離率Table 1 Isolation rate of endophytic fungi from roots,stems and leaves of S.suffruticosa species or varieties

通過(guò)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，觀察各內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)可以看出，葉底珠的內(nèi)生真菌在生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)上存在較多差異，具有較為豐富的形態(tài)多樣性，表明分離到菌株的多樣性和其分類地位的不同。而且產(chǎn)色素方面也存在較多差異，有產(chǎn)乳白色、深褐色、紫紅色、棕黃色等，而部分真菌僅為白色。有部分真菌觀察生長(zhǎng)有孢子囊和孢子，大部分真菌未觀察到孢子，可能為不產(chǎn)孢真菌，可能與培養(yǎng)條件有關(guān)。

2.2 葉底珠內(nèi)生真菌抗菌活性

表2 葉底珠內(nèi)生真菌對(duì)的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activity of fungal endophytes isolated from S.suffruticosa

用分離到的41株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其中有2株菌G1和D1的菌體待測(cè)溶液和發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌的抑菌效果都比較明顯，抑菌圈直徑達(dá)到15 mm以上。又進(jìn)一步將G1和D1的菌體待測(cè)溶液和發(fā)酵液，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌，小麥赤霉病菌、立枯絲核菌和辣椒炭疽病菌作為指示菌，進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，結(jié)果顯示內(nèi)生真菌對(duì)多種指示菌具有明顯抑制作用，表現(xiàn)出顯著的抑菌廣泛性，而且菌體待測(cè)溶液的效果好于發(fā)酵液，內(nèi)生真菌G2和D1對(duì)細(xì)菌的抑制效果好于真菌。由表2可見(jiàn)，內(nèi)生真菌菌株G11對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和小麥赤霉病菌的抑菌圈直徑大于20 mm，菌株D11對(duì)大腸埃希菌和小麥赤霉病菌的抑菌圈直徑大于20 mm，表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抑制活性，值得進(jìn)一步研究。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑<10 mm為低敏，10～14 mm 為中敏，15～19 mm 為高敏，>20 mm 為極敏[18]。

2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

菌株G11分離自葉底珠的根。查氏固體培養(yǎng)基上菌落橢圓形，周圍為白色菌絲，邊緣整齊，背面呈淺黃色；菌絲有隔；查氏培養(yǎng)基上未見(jiàn)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。菌株D11分離自葉底珠的葉。查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落近圓形，顏色先由白色變成棕黃色，邊緣不整齊，背面呈黃色；菌絲有隔；孢子呈圓形或橢圓形，棕黑色；有剛毛結(jié)構(gòu)。

再采用Mega 5.2軟件，用Neighbor-Joining(NJ) 法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析觀察表明，通過(guò)分離篩選得到的菌株G11，與GenBank上下載的多株球毛殼菌Chaetomiumglobosum能很好地聚在一個(gè)進(jìn)化分枝中，見(jiàn)圖1，并有99%的支持率，結(jié)合培養(yǎng)特征，確定其為毛殼屬的球毛殼菌Chaetomiumglobosum。菌株D11與GenBank上下載的多株枝細(xì)枝孢菌Cladosporiumramotenellum能很好地聚在一個(gè)進(jìn)化分枝中，見(jiàn)圖1，并有100%的支持率，結(jié)合培養(yǎng)特征，確定其為枝孢屬的枝細(xì)枝孢菌Cladosporiumramotenellum。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

內(nèi)生真菌廣泛存在于植物體內(nèi)，其種類和數(shù)量與宿主植物種類、部位、生長(zhǎng)狀況，自然環(huán)境等密切相關(guān)。內(nèi)生真菌對(duì)寄主具有一定的偏好性，寄主植物種類是決定內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的重要因素之一，如座囊菌綱的格孢菌目是草本植物中較為普遍的內(nèi)生真菌[19-20]。

本研究表明，從葉底珠根莖葉組織中分離獲得了41株內(nèi)生真菌，并具有多種的形態(tài)和活性特征，可見(jiàn)其內(nèi)生真菌的數(shù)量多種類非常豐富。本課題組還研究發(fā)現(xiàn)葉底珠內(nèi)生真菌中，毛殼屬Chaetomium是葉底珠的優(yōu)勢(shì)屬(未發(fā)表)，而且在根、莖、葉中均有分布。毛殼屬的菌株是常見(jiàn)的植物內(nèi)生真菌，在棗樹(shù)[21]和枸杞[22]等植物的內(nèi)生真菌中也發(fā)現(xiàn)了毛殼屬是優(yōu)勢(shì)屬，在銀杏[23]、溫郁金[24]、玉米[25]甚至深海沉積物樣品[26]中，都分離到過(guò)毛殼屬的菌株，部分毛殼屬的菌株還具有多種活性成分，常作為生防菌對(duì)植物病原菌具有很好的防治效果。傳統(tǒng)藥用植物白茅Imperatacylindrical中分離獲得的一株內(nèi)生菌球毛殼菌C.globosum能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎和藥理活性顯著的化學(xué)成[27]。在側(cè)柏內(nèi)生真菌球毛殼菌C.globosumZH-32 的次生代謝物中分離鑒定出球毛殼菌素A，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種病原細(xì)菌及農(nóng)業(yè)上危害嚴(yán)重的植物病原真菌具有強(qiáng)烈的抑制作用[28]。發(fā)現(xiàn)藥用植物三七的內(nèi)生菌C.globosum的代謝產(chǎn)物能抑制植物病原菌生長(zhǎng)，具有抗氧化活性，還可以抑制乙酰膽堿酯酶[29]。枝孢屬Cladosporium的菌株也是廣泛存在于植物中的內(nèi)生真菌，在越南槐、月季、康乃馨、玫瑰、山茶花和鳳凰木中是優(yōu)勢(shì)菌群[30-31]，在角果木[32]、山蒼子[33]、蒜頭果[34]等植物中都有發(fā)現(xiàn)，研究還發(fā)現(xiàn)角果木內(nèi)生真菌C.cladosporioidesJG-12的活性代謝產(chǎn)物能抗菌，抑制乙酰膽堿酯酶活性以及抑制全齒復(fù)活線蟲(chóng)活性[32]。

本實(shí)驗(yàn)分離到41株內(nèi)生真菌，其中21株來(lái)自根部，其中具有最佳抑菌活性的2 株菌株分別是Chaetomium屬和Cladosporium屬的真菌，而且對(duì)多種指示菌具有抑制作用，表現(xiàn)出廣泛的抑菌性，所以內(nèi)生真菌ChaetomiumglobosumG11和CladosporiumramotenellumD11的活性代謝產(chǎn)物有待分析、分離，將在新型抗菌、抗腫瘤、治療神經(jīng)衰弱藥物的篩選方面具有較好的研究?jī)r(jià)值。內(nèi)生真菌與植物長(zhǎng)期共生，在一定程度上影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌也具有一定的作用效果，表明內(nèi)生真菌在提高藥用植物培養(yǎng)繁殖，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)上，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。