張 慧 劉培俊 黃 華 黃 敏

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是1類具有自我更新和多項(xiàng)分化能力的干細(xì)胞，在組織修復(fù)，器官再生治療中得到一定的臨床效果[1]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有向腫瘤組織趨化和低免疫原型的特性，與腫瘤組織的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[2-3]。本文就BMSCs對Balb/c-nu裸鼠皮下移植肺癌組織的生長和凋亡進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～4周齡Balb/c-nu雌性裸鼠由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)和處理符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 材料

人BMSCs細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫； DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；RNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)；基因引物由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。Annexin V-FITC/PI凋亡染色試劑盒購自貝博生物科技有限公司。

1.3 BMSCs細(xì)胞表型鑒定

取第3代BMSCs細(xì)胞，制成1×106/ml細(xì)胞懸液。各取100 μl，分別加入CD14、CD19、CD34、CD44、CD45、CD73、CD166抗體10 μl，避光孵育30 min，洗滌。流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析結(jié)果。

1.4 肺癌A549裸鼠移植瘤模型建立

30只裸鼠采用細(xì)胞接種的方法，取1×106A549肺癌細(xì)胞懸液接種于左腋下皮下。約4周后腫瘤結(jié)節(jié)直徑達(dá)5 mm左右，活動(dòng)度可。隨機(jī)將30只裸鼠分為3組，分別為PBS溶液注射組，BMSCs培養(yǎng)上清組，BMSCs移植組。

1.5 BMSCs靜脈注射

取第3代BMSCs細(xì)胞，制成1×107/ml細(xì)胞懸液。各取100 μl，經(jīng)裸鼠靜脈注射細(xì)胞懸液。PBS溶液注射組，BMSCs培養(yǎng)上清組分別注射等量體積的PBS溶液和BMSCs培養(yǎng)上清液。每3天注射一次，維持4周。每3天測量腫瘤最長徑a；最短徑b，計(jì)算體積變化(V=0.5ab2)。4周后處死裸鼠，取肺癌組織塊。

1.6 A549肺癌細(xì)胞分離

用手術(shù)剪將肺癌組織塊剪成小塊(約1 mm2)，沖洗，加入0.25%胰酶消化組織塊，37 ℃中消化30 min，沖洗，后轉(zhuǎn)移至25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞。

1.7 MTT法檢測A549細(xì)胞增殖率

消化各組肺癌A549細(xì)胞，制成2×104ml細(xì)胞懸液。取100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)平行孔。分別培養(yǎng)0、24、48、96 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，震蕩10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm波長吸光值(OD值)。

1.8 RT-PCR檢測A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)

用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR?；蛞颬53，P21，Bax，Bcl-2，Caspase-3和β-actin如表1所示。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡率

消化各組肺癌A549細(xì)胞，制成1×106ml細(xì)胞懸液。PBS洗滌，離心。將細(xì)胞重懸于150 μl的緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染液，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 Real-time PCR序列

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，BMSCs高表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD44、CD73、CD90、CD166;不表達(dá)單核細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD14，不表達(dá)淋巴細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD19，不表達(dá)造血干細(xì)胞細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD34，不表達(dá)白細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD45(表2)。

表2 BMSCs表面標(biāo)記陽性率/%

2.2 BMSCs對Balb/c-nu裸鼠肺癌生長的影響

根據(jù)Balb/c-nu裸鼠肺癌體積變化量，發(fā)現(xiàn)BMSCs移植組肺癌體積變化量小于PBS組和BMSCs上清組。在第27天，BMSCs移植組肺癌體積為(77.235±0.426)；而PBS組和BMSCs上清組肺癌體積分別為(85.360±0.225)和(84.177±0.549)(圖1)。

圖1 Balb/c-nu裸鼠肺癌生長體積變化

2.3 BMSCs對Balb/c-nu裸鼠肺癌細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，在24、48和96小時(shí)觀察點(diǎn)，BMSCs移植組肺癌細(xì)胞增殖率明顯低于PBS組和BMSCs上清組，而PBS組和BMSCs上清組之間細(xì)胞增殖未見明顯差異(圖2)。

圖2 各時(shí)間點(diǎn)Balb/c-nu裸鼠肺癌細(xì)胞增殖情況

2.4 BMSCs對Balb/c-nu裸鼠肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響

RT-PCR結(jié)果表明，BMSCs移植組肺癌細(xì)胞的P53、P21、Bax、Caspase-3表達(dá)量均明顯高于PBS組和BMSCs上清組，而PBS組和BMSCs上清組肺癌細(xì)胞之間表達(dá)未見明顯差異。BMSCs移植組肺癌細(xì)胞的Bcl-2的表達(dá)量明顯低于PBS組和BMSCs上清組(圖3)。

2.5 BMSCs對Balb/c-nu裸鼠肺癌細(xì)胞凋亡的影響

凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植組肺癌細(xì)胞的凋亡率為(17.09±1.92)%，明顯高于PBS組和BMSCs上清組肺癌細(xì)胞凋亡率，該兩組細(xì)胞凋亡率分別為(6.47±1.82)%和(5.88±1.39)%。

3 討論

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，隨著我國人口老齡化和環(huán)境污染程度加重，伴隨吸煙等不良習(xí)慣的人群增多，我國肺癌發(fā)病率每年呈現(xiàn)26.9%的增長[4]。肺癌已成為我國惡性腫瘤死亡的最主要原因，而肺癌患者總體5年生存率低于15%[4-6]。臨床上，對于肺癌的治療方法有限，療效不佳[6]。因此探討1種新的治療肺癌的方法具有重要的意義。

BMSCs是骨髓組織一類具有自我更新、多向分化和損傷趨化特性的非造血性多能干細(xì)胞，來源和取材方便。本研究使用的BMSCs高表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD44，CD73，CD90，CD166;不表達(dá)單核細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD14，不表達(dá)淋巴細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD19，不表達(dá)造血干細(xì)胞細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD34，不表達(dá)白細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD45。符合BMSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[7]。由于BMSCs的多向分化能力及免疫抑制等特征，已被應(yīng)用與自身免疫性疾病和移植物抗宿主病的治療[8-9]。目前，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs具有腫瘤歸巢和免疫原性低等優(yōu)勢，嘗試將BMSCs作為趨化因子、細(xì)胞因子的載體應(yīng)用于腫瘤的治療中，以期獲得較好的療效[10]。在體外研究中，Wang等[11]發(fā)現(xiàn)BMSCs在可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)A549凋亡。本文探討B(tài)MSCs對Balb/c-nu裸鼠肺癌A549細(xì)胞生長和凋亡的作用，從而為臨床運(yùn)用BMSCs治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。

目前對于BMSCs與腫瘤細(xì)胞之間的體內(nèi)相互作用關(guān)系尚未明確。Brennen等[12]發(fā)現(xiàn)BMSCs可以被前列腺組織募集并促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長和惡化。Qi等[13]發(fā)現(xiàn)BMSCs可分泌外泌體促進(jìn)骨肉瘤的增長和轉(zhuǎn)移。但是，Camorani等[14]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs分泌的細(xì)胞因子可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中，為了探究BMSCs與肺癌A549細(xì)胞之間的相互關(guān)系，構(gòu)建了肺癌A549皮下移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs移植可以減緩肺癌A549細(xì)胞生長的速度。BMSCs移植處理后的肺癌A549細(xì)胞增殖速度下降。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的異常凋亡和腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有著密切的關(guān)系[15-16]。P53基因?qū)儆谌梭w抑癌基因，其可通過P21下游基因與Cyclin-cdk 復(fù)合物結(jié)合，抑制相關(guān)的蛋白激酶活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加[17]。BMSCs移植組的肺癌A549細(xì)胞P53，P21凋亡相關(guān)基因表達(dá)明顯高于PBS組和BMSCs上清組肺癌細(xì)胞，提示BMSCs移植可以促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族在腫瘤凋亡中也發(fā)揮重要的作用，Bax與Bcl-2的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生和發(fā)展。Bax是促進(jìn)凋亡的蛋白，而Bcl-2是抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的蛋白。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)BMSCs移植組的肺癌A549細(xì)胞Bax，caspase-3凋亡相關(guān)基因表達(dá)明顯高于PBS組和BMSCs上清組肺癌細(xì)胞，而Bcl-2明顯低于PBS組和BMSCs上清組肺癌細(xì)胞。這提示BMSCs移植可以通過Bax和caspase-3通路促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。另外，流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示BMSCs移植組的肺癌A549細(xì)胞凋亡率明顯高于PBS組和BMSCs上清組肺癌細(xì)胞。進(jìn)一步表明BMSCs移植可以促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。BMSCs移植減緩肺癌A549細(xì)胞生長的具體機(jī)制可能通過BMSCs分泌的外泌體或者細(xì)胞因子，或者通過直接與肺癌A549相互接觸從而抑制肺癌A549細(xì)胞生長。

圖3 Balb/c-nu裸鼠肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況

本研究表明，BMSCs移植能夠減緩肺癌組織生長，移植肺癌A549細(xì)胞增殖，增加其凋亡相關(guān)基因表達(dá)并促進(jìn)其凋亡。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。