王景順

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校一附院(漯河市中心醫(yī)院)輸血科，河南 漯河 462000)

免疫性血小板減少癥是由于機(jī)體免疫功能失調(diào)而導(dǎo)致的血小板破壞增加或血小板生成減少，免疫性血小板減少癥包括原發(fā)性和繼發(fā)性?xún)煞N[1，2]。原發(fā)免疫性血小板減少癥即特發(fā)性血小板減少性紫癜（idopathi thrombocytopenic purpura，ITP），即無(wú)明確病因且有抗體介導(dǎo)的血小板被機(jī)體巨噬細(xì)胞系統(tǒng)所破壞以及無(wú)明確病因血小板生成受抑制[2]。在血小板減少孕婦中，ITP約占4%，患有ITP的孕婦其免疫球蛋白G（IgG）能夠形成自身抗體，而母體內(nèi)的IgG自身抗體則能通過(guò)胎盤(pán)導(dǎo)致新生兒免疫性血小板減少癥 （Neonatal immune thrombocytopenia，NITP）[3]。 在疾病的診斷以及療效判定方面，血小板抗體檢測(cè)具有著重要作用，目前主要報(bào)道的檢測(cè)方法包括流式細(xì)胞儀（FCM）、簡(jiǎn)易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)技術(shù)（SEPSA）、單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(shù)（MAIPA）等，但是由于此類(lèi)檢測(cè)方法操作繁瑣，設(shè)備以及成本要求高，因此無(wú)法在臨床工作中得到廣泛運(yùn)用[4]。微柱凝膠免疫分析技術(shù)（MGIA）是近年來(lái)興起的新的血小板抗體檢測(cè)和交叉配型技術(shù)，目前已有相關(guān)報(bào)道顯示[5]，MGIA在新生兒同種免疫性血小板減少癥患兒血小板同種抗體檢測(cè)中獲得了良好的應(yīng)用效果。本研究探討分析MGIA技術(shù)診斷新生兒免疫性血小板減少癥自身抗體的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年8月－2017年4月在我院出生診斷為血小板減少癥的新生兒172例作為研究對(duì)象，入組172例患兒均符合《實(shí)用新生兒學(xué)》中新生兒血小板減少癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，其外周血血小板計(jì)數(shù)均＜100×109/L。其中男97例、女75例，日齡 1d～30d，平均日齡（13.62±3.96）d，其中足月兒78例、早產(chǎn)兒94例。此外，選擇20例在我院臨床確診的非免疫性血小板減少癥新生兒作為對(duì)照，其中男12例、女 8例，日齡 3d～30d，平均日齡（14.52±4.18）d。 兩組年齡在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異。

1.2 試劑及儀器 微柱凝膠血小板抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司；FYQ型免疫微柱孵育器購(gòu)于長(zhǎng)春博速生物技術(shù)有限公司；TD－3A型血型血清學(xué)用離心機(jī)購(gòu)于長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞儀（FACScalibur）及其相關(guān)試劑均購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3 MGIA法檢測(cè)自身抗體 采集血小板減少患兒及自身抗體檢測(cè)陽(yáng)性患兒母體3～5ml外周血，將其置于EDTA抗凝離心管內(nèi)，800r/min離心10min后分離部分血漿，使用剩余血漿懸浮壓積血小板并將血小板濃度調(diào)節(jié)為（100±50）×109/L。將調(diào)節(jié)好濃度的血小板懸液貯存于塑料容器內(nèi)待測(cè)將血小板抗體微柱凝膠檢測(cè)卡分別設(shè)置樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，分別加入待測(cè)血漿、陰性對(duì)照試劑以及陽(yáng)性對(duì)照試劑。參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，在樣本孔內(nèi)加入低例子強(qiáng)度鹽溶液50μl、血小板懸液50μl、血小板指示紅細(xì)胞25μl；在陰性對(duì)照微孔以及陽(yáng)性對(duì)照微孔加入低離子強(qiáng)度鹽溶液50μl、血小板廣譜裂解抗原50μl、血小板指示紅細(xì)胞25μl。將檢測(cè)卡放置于免疫微柱孵育器中37℃孵育15min，然后使用專(zhuān)用離心機(jī)900r/min離心2min，1500r/min離心3min[6－9]。結(jié)果判斷：紅細(xì)胞凝集塊位于凝膠表面或者凝膠中為陽(yáng)性；紅細(xì)胞完全沉降于凝膠管底部為陰性。

1.4 FCM法檢測(cè)自身抗體 取血小板減少患兒（或母親）全血 3ml，加入 0.109mol/L 枸櫞酸鈉 400μl，混勻后離心15min（790r/min）；取血漿加入1ml 2%PFA 后避光固定 15min，離心 5min（5000r/min）棄去上清液，加入2ml PBS混勻后離心5min（5000r/min）棄去上清液。根據(jù)血小板計(jì)數(shù)配置抗體，血小板計(jì)數(shù) 3×109/L 加入 1μl FITC－抗人 IgG，（4～5）×109/L 加入 1.5μl FITC－抗人 IgG，（5～7）×109/L 加入2μl FITC－抗人 IgG，＞7×109/L 加入 2.5μl FITC－抗人IgG。將1支上樣管加入5μl濃血小板懸液以及10μl FITC－抗人IgG作為陽(yáng)性對(duì)照，再取另外1支上樣管加入5μl濃血小板懸液作為陰性對(duì)照組。將上述準(zhǔn)備好的血小板混液放置避光處20min，加入0.5ml PBS 后上機(jī) （SYSMEX－K4500 血細(xì)胞分析儀）檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGIA對(duì)非免疫性血小板減少癥新生兒檢查情況 MGIA對(duì)20例臨床確診的非免疫性血小板減少癥新生兒檢出結(jié)果均為陰性。

2.1 兩種方法檢測(cè)患兒血小板自身抗體 流式細(xì)胞儀法檢出血小板減少癥自身抗體患兒21例、檢出陽(yáng)性率為12.21%，微柱凝膠法檢出血小板減少癥自身抗體患兒20例、檢出陽(yáng)性率為11.63%，兩組檢出陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種方法檢測(cè)患兒血小板自身抗體情況（例）

2.2 兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性患兒母親血小板自身抗體檢測(cè)陽(yáng)性21例患兒母親血小板自身抗體，微柱凝膠法檢出母親血小板自身抗體19例，檢出陽(yáng)性率90.48%，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢出母親血小板自身抗體21例，檢出陽(yáng)性率100.00%，兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性患兒母親血小板自身抗體檢出陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性患兒母親血小板自身抗體

3 討論

引發(fā)新生兒血小板減少的原因主要包括獲得性免疫性、藥物性、感染性以及遺傳性等，其中以獲得性免疫性為主[10]。對(duì)于免疫性血小板減少癥，目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)一項(xiàng)特異性的實(shí)驗(yàn)室檢查手段能夠?qū)ζ浯_診。在臨床工作當(dāng)中，眾多的非免疫性血小板減少癥患兒常常被臨床誤診為免疫性血小板減少癥，而基于免疫抑制劑、免疫球蛋白或糖皮質(zhì)激素治療，引發(fā)患兒發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥或給患兒家庭帶來(lái)了不必要的經(jīng)濟(jì)損失[11]。因此對(duì)于新生兒免疫性血小板減少癥的臨床鑒別，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療工作具有著重要的臨床意義。

血小板自身抗體其產(chǎn)生機(jī)制目前尚未明確，血小板自身抗體可引起新生兒免疫性血小板減少癥，血小板自身抗體為絕大部分的IgG以及少部分IgM，對(duì)于此類(lèi)自身抗體的檢測(cè)，目前常用的方法包括FCM、SEPSA、MAIP法，雖然準(zhǔn)確率高，但檢驗(yàn)步驟繁瑣且設(shè)備要求高，而固相凝集法以及血小板免疫熒光試驗(yàn)等，由于新生兒不易獲得放散所需的足夠血小板，因此檢測(cè)準(zhǔn)確性不高[12－14]。流式細(xì)胞儀技術(shù)能夠檢測(cè)血小板相關(guān)抗體，在數(shù)秒時(shí)間內(nèi)對(duì)上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算，并對(duì)細(xì)胞表面的多參數(shù)進(jìn)行分析，是新生兒免疫性血小板減少癥診斷的一個(gè)重要手段，但是流式細(xì)胞儀技術(shù)設(shè)備要求高，檢測(cè)成本較大。微柱凝膠法作為一種新型的血清檢測(cè)技術(shù)，其主要工作原理為分子篩，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)與凝膠分子篩相結(jié)合，檢測(cè)時(shí)游離的紅細(xì)胞能夠自由穿過(guò)凝膠柱；而當(dāng)抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)凝集紅細(xì)胞則由于體積過(guò)大則無(wú)法穿過(guò)凝膠柱上的分子篩，因此凝集的紅細(xì)胞則懸浮在凝膠柱上，進(jìn)而能夠分別出游離紅細(xì)胞以及凝集的紅細(xì)胞[9]。此外，微柱凝膠法可在檢測(cè)時(shí)將抗人球蛋白以及血型抗體提前放入檢測(cè)孔，無(wú)需逐一加入相應(yīng)的檢測(cè)物，從而簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，降低人為因素的誤差[15]。

本研究探討分析微柱凝膠免疫法診斷新生兒免疫性血小板減少癥臨床價(jià)值，并于流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果相比較，結(jié)果顯示，對(duì)于新生兒血小板減少癥患兒自身抗體的檢測(cè)，微柱凝膠法與流式細(xì)胞技術(shù)均無(wú)顯著差異；此外，針對(duì)自身抗體檢出陽(yáng)性的患兒母親進(jìn)行自身抗體的檢測(cè)，結(jié)果顯示，微柱凝膠法檢出母親血小板自身抗體陽(yáng)性率90.48%，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢出母親血小板自身抗體陽(yáng)性率100%，兩種方法比較，檢出陽(yáng)性率無(wú)顯著差異。表明微柱凝膠免疫法與流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)新生兒免疫性血小板減少癥自身抗體無(wú)明顯差異，而微柱凝膠免疫法其操作簡(jiǎn)單，有助于新生兒免疫性血小板減少癥的臨床鑒別及早期治療方案的確定。此外，MGIA對(duì)20例臨床確診的非免疫性血小板減少癥新生兒檢出結(jié)果均為陰性。進(jìn)一步提示MGIA對(duì)免疫性血小板減少癥新生兒具有較高的特異性。