張馨默，劉麗萍*

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150000）

花藥培養(yǎng)是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將花藥進(jìn)行無(wú)菌操作接種到人工培養(yǎng)基上，通過(guò)改變小孢子的發(fā)育途徑，使其誘導(dǎo)分化，進(jìn)行連續(xù)的有絲分裂，形成細(xì)胞團(tuán)，繼而形成愈傷組織后胚狀體，最終分化成完整的植株。印度Guha等最早針對(duì)毛曼陀羅的離體花藥，誘導(dǎo)出單倍體植株，而后花藥培養(yǎng)法被運(yùn)用到煙草上，并受到世界的廣泛關(guān)注。此后，人們陸續(xù)開展了對(duì)觀賞性植物的花藥培養(yǎng)研究。

花藥培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用價(jià)值：一是可縮短育種年限，加速育種進(jìn)程。通過(guò)對(duì)獲得的單倍體植株進(jìn)行染色體加倍，從而獲得純合的二倍體植株；二是對(duì)育種研究提供原材料。通過(guò)鑒定和選擇滿意的基因組合，對(duì)遺傳變異方面的研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)；三是提供了外源基因的轉(zhuǎn)化受體，從而利于外源基因的整合與表達(dá)。

矮牽牛（Petunia hybrid Vilm），又名碧科茄、靈芝牡丹、撞羽牽牛等，為茄科矮牽牛屬一年生或多年生的半蔓性草本花卉。其品種豐富、系列繁多，包括阿根廷系列、云系列、夢(mèng)幻系列、魅力系列、地毯系列、梅林系列等。因其具有鮮艷豐富的色彩、較長(zhǎng)的花期和適應(yīng)能力、較好的耐熱性及觀賞性，被廣泛地用于城市綠化和室內(nèi)盆栽等。在種子的獲取方面所面臨的問(wèn)題有：播種繁殖，采種困難；進(jìn)口雜交種，價(jià)格昂貴；扦插繁殖，成活率低等。

因此，針對(duì)矮牽牛的需求量的增加以及需求品種的多樣化，通過(guò)花藥培養(yǎng)可快速獲得純合二倍體以及隱形突變體，并能縮短育種周期、提高選擇效率。而目前在矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)的技術(shù)研究方面還遠(yuǎn)不如禾本科植物成熟，例如，水稻、小麥等。通過(guò)本試驗(yàn)研究，旨在明確矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)的最佳培養(yǎng)條件、總結(jié)有關(guān)花藥培養(yǎng)中的影響因素和培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意到的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料選擇

以矮牽牛“梅林系列”紅色品種為試驗(yàn)材料。于晴天上午10時(shí)從健壯無(wú)病毒的植株中采集花蕾，首先對(duì)小孢子發(fā)育時(shí)期進(jìn)行觀察，通過(guò)醋酸洋紅染色，再進(jìn)行壓片鏡檢，確定小孢子的發(fā)育時(shí)期與花蕾直徑的相關(guān)性。選取小孢子發(fā)育時(shí)期處于單核靠邊期的花蕾做試驗(yàn)，花蕾直徑在1.5～2.0mm。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

MS、B5、N6 基本培養(yǎng)基與 2，4-D 、6-BA、NAA、IBA、IAA等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑按照不同比例混合，部分培養(yǎng)基中需加入瓊脂和麥芽糖，培養(yǎng)基pH值為5.8。培養(yǎng)室溫度為25±2℃，愈傷組織的誘導(dǎo)需要暗培養(yǎng)，愈傷組織分化的光照周期為14h/d，光照強(qiáng)度為3000lx。

1.3 預(yù)處理與接種

首先剝?nèi)セㄝ?，? mol/L的HCL處理60s后用流水清洗數(shù)遍，再用70%乙醇浸泡2 min，流水沖洗干凈。用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，大約15 min。將處理后的花蕾剪下，放在4℃的恒溫冰箱中冷藏，冷藏時(shí)間設(shè)置4組對(duì)照，即12h、24h、48h、72h。之后在干凈無(wú)菌的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使用70%的酒精處理花蕾1 min，無(wú)菌水沖洗3次（約15 min）。最后用0.1%的HgCl2消毒，消毒時(shí)間設(shè)置 4組對(duì)照，即 6min、8min、10min、12 min，無(wú)菌水沖洗 5次（約30 min），后用吸水紙吸干花蕾表面的水分。接種前使用滅菌后的解剖刀或鑷子小心地剝?nèi)セò?，取出花藥，去除花絲。將花藥散落接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置3種，即MS、B5、N6且與不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、瓊脂和麥芽糖混合配制，每個(gè)平皿中接種10個(gè)花藥，每個(gè)處理接種5瓶，用parafilm封口膜封好平皿，進(jìn)行暗培養(yǎng)。每7d觀察一次愈傷組織的誘導(dǎo)情況，30d后統(tǒng)計(jì)最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率。

1.4 愈傷組織的分化

愈傷組織誘導(dǎo)完成后，需在新配置的培養(yǎng)基（即3種基本培養(yǎng)基與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑混合配置）中進(jìn)行光培養(yǎng)，每個(gè)瓶皿中接種5塊愈傷組織，每處理接種10瓶。每10d觀察一次愈傷組織的分化情況，30d后統(tǒng)計(jì)最佳分化培養(yǎng)基的分化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾直徑與小孢子發(fā)育階段的關(guān)系

通過(guò)壓片鏡檢可觀察出：當(dāng)花蕾直徑≤1.5mm時(shí)，小孢子處于四分體時(shí)期，此時(shí)的花藥呈綠色扁平狀；花蕾直徑在1.5～2.0mm時(shí)，小孢子處于單核靠邊時(shí)期，此時(shí)的花藥呈綠色略飽滿狀，適合做培養(yǎng)材料；當(dāng)花蕾直徑≥2.0mm時(shí)，小孢子處于雙核時(shí)期，此時(shí)的花藥逐漸變成黃色呈飽滿狀。

2.2 冷藏時(shí)間對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

接種前，對(duì)花藥進(jìn)行低溫預(yù)處理，有利于提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。試驗(yàn)表明，隨著冷藏時(shí)間的增加，誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢(shì)。在4組對(duì)照組中，冷藏48h后的誘導(dǎo)率最高，達(dá)27.54%。48h后誘導(dǎo)率降低的原因可能是花藥失水受損而導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物供不應(yīng)求。

2.3 0.1%HgCl2的消毒時(shí)間對(duì)花蕾污染的影響

對(duì)花蕾進(jìn)行HgCl2滅菌消毒，可減少污染、預(yù)防花藥受損。試驗(yàn)結(jié)果顯示消毒時(shí)間與花蕾的污染率呈反比，最終可達(dá)到零污染的效果。但是HgCl2存在毒性，對(duì)花蕾作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)毒害細(xì)胞。消毒10 min為最佳滅菌時(shí)間，此時(shí)的污染率基本降低到10%左右，污染率較低且對(duì)細(xì)胞基本無(wú)損傷，也可保護(hù)花藥免受污染。

2.4 不同碳源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

不同種類的培養(yǎng)基中分別添加蔗糖、麥芽糖、白砂糖作為碳源，對(duì)比愈傷組織誘導(dǎo)及分化效果好的碳源種類與濃度。試驗(yàn)得出麥芽糖對(duì)提高愈傷組織的誘導(dǎo)率最明顯，當(dāng)麥芽糖的濃度為20g/L時(shí)的誘導(dǎo)率為29.02%，其次是蔗糖，而白砂糖的效果不佳。

2.5 不同基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

培養(yǎng)基的種類對(duì)花藥愈傷組織的誘導(dǎo)、分化起著重要的作用。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)N6、B5、MS三種基本培養(yǎng)基的比較研究，篩選確定出最適合誘導(dǎo)出愈傷組織的培養(yǎng)基N6，其誘導(dǎo)率最高，而B5培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率則不是很明顯，MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率比較適中。對(duì)于最適分化培養(yǎng)基的選擇，試驗(yàn)表明MS基本培養(yǎng)基比N6基本培養(yǎng)基的分化率高，愈傷組織的分化效果明顯。

2.6 參與配制的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類與濃度對(duì)誘導(dǎo)率及分化率的影響

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是通過(guò)很低的濃度來(lái)促進(jìn)或抑制植物生命活動(dòng)中的某些過(guò)程，所以往往起到量小作用大的效果，本試驗(yàn)中所用到的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括：生長(zhǎng)素2，4-D、IBA、IAA，細(xì)胞分裂素6-BA、NAA。在比較不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組成中，發(fā)現(xiàn)對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳組合為N6+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA其誘導(dǎo)率可達(dá)36.82%，此時(shí)其基部可產(chǎn)生大量的愈傷組織；而對(duì)于分化培養(yǎng)基的最佳組合為MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA其分化率可達(dá)43.75%，此時(shí)愈傷組織分化出芽量較高并且可保持褐化量較少。誘導(dǎo)培養(yǎng)基與分化培養(yǎng)基的配制方法，見表1及表2。

表1 N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方（單位：g/L）

表2 MS分化培養(yǎng)基配方（單位：g/L）

試驗(yàn)表明，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度不能過(guò)高，當(dāng)其超出一定值時(shí)就會(huì)抑制愈傷組織的誘導(dǎo)效果或分化效果。如細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)提高愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著的效果，但是當(dāng)其濃度高于1.5mg/L時(shí)又會(huì)抑制愈傷組織的形成。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)一系列的對(duì)照研究，確定出矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基與分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)配方。其中，在培養(yǎng)過(guò)程中起重要作用的有對(duì)花藥的選擇方面、對(duì)花藥接種前的處理方面，以及對(duì)培養(yǎng)基配制中各成分與濃度劑量的確定方面。研究得出：花蕾直徑在1.5～2.0mm的花藥處于單核靠邊期的較好；預(yù)處理中，冷藏溫度在4℃、時(shí)間在48h，滅菌時(shí)間在10min為宜；培養(yǎng)基中的碳源選擇麥芽糖對(duì)提高愈傷組織的誘導(dǎo)率效果比蔗糖和白砂糖明顯；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑針對(duì)不同作用的培養(yǎng)基的選擇和濃度確定是不同的，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中需1.5mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA，分化培養(yǎng)基中則需0.5mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA。

矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)成功的關(guān)鍵在于培養(yǎng)過(guò)程中的無(wú)菌操作。一是保證花藥的無(wú)菌獲取，即在對(duì)花蕾進(jìn)行預(yù)處理消毒滅菌時(shí)，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)的超凈無(wú)菌。而且牽?；ǖ幕ɡ俦砻姘欢探q毛，易受污染，所以應(yīng)保證對(duì)花蕾或花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)移時(shí)周圍環(huán)境的潔凈無(wú)菌、無(wú)污染；二是保證對(duì)誘導(dǎo)后的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移時(shí)的無(wú)菌操作。

不同梯度的對(duì)比試驗(yàn)組是研究有關(guān)影響因素的重要方法，其中涉及控制唯一變量的原則，以及試驗(yàn)現(xiàn)象的定期觀察、試驗(yàn)結(jié)果的判斷與數(shù)據(jù)計(jì)算。本試驗(yàn)中涉及到數(shù)據(jù)計(jì)算包括：誘導(dǎo)率=成功誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量/接種花藥的數(shù)量；分化率=成功分化的愈傷組織數(shù)量/接種愈傷組織的數(shù)量。

一是花藥培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)矮牽?；ǖ目焖倥嘤?、縮短其繁殖周期，但仍存在繁殖率低的問(wèn)題。主要原因在于部分花胚的發(fā)生率較低，從而降低了其應(yīng)用價(jià)值，所以有待于針對(duì)其基因方面進(jìn)行深入研究；二是在小孢子的發(fā)育調(diào)控機(jī)理方面的研究還不夠成熟，若能明確此方面的機(jī)理，將有助于進(jìn)行對(duì)目的性狀的篩選，可增加定向突變；三是花藥培養(yǎng)過(guò)程難免會(huì)受矮牽牛植物本身的體細(xì)胞影響，可通過(guò)適當(dāng)?shù)母淖兩L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和碳源的濃度來(lái)減緩其影響，但對(duì)于解決問(wèn)題的關(guān)鍵仍需進(jìn)一步的深入研究。