李琦，成莉鳳,#，汪啟明，劉清波, 羅瑋，彭源德*

(1.中國農業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

酶是具有生物催化功能的高分子物質，可通過人工合成法和生物合成法兩種途徑獲取。生物合成法就其來源可分為動物酶、植物酶和微生物酶三大類。微生物酶是由微生物細胞產生的蛋白質，可催化生物體系中的特定反應，其催化作用具有底物特異性、位置特異性、立體特異性等特點。與化學催化劑相比，微生物酶的催化作用具有高效性和專一性，因此，微生物酶廣泛應用于制藥、造紙、紡織、飼料、食品、皮革等工業(yè)領域[1-3]。

自然界中微生物族群數量龐大，但目前為止人類獲得的微生物種類和數量仍非常有限，而能應用于工業(yè)生產中的微生物酶則更少。通過全面解析目標酶的溶解性、等電點、分子量等理化性質，選擇合適的后處理方法，對后續(xù)的功能開發(fā)和實際應用均十分必要。本文結合微生物酶的菌種篩選、菌種改良、發(fā)酵工藝等環(huán)節(jié)，重點對酶的后處理方法進行綜述，以期為微生物工業(yè)酶資源發(fā)掘提供科學依據。

1 微生物酶的菌種來源

1.1 菌種篩選

從特殊生境中采集樣品，采用選擇培養(yǎng)基初篩，以目標活力大小為指標復篩，是一種能獲得產酶周期短、酶活力高的優(yōu)良菌種的簡便高效方法。李豪等[4]從腐殖質土壤中用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基初篩，再經過酶活復篩得到一株高產纖維素酶菌株BacillussubtilisB17，其羧甲基纖維素酶(CMC酶)酶活達85.48 U/mL、濾紙酶(FPA酶)酶活達59.8 U/mL，在農作物秸稈飼料的生產方面具有潛在的開發(fā)價值。張慶芳等[5]以大連黃海海泥和海水為材料，分別采用透明圈法、酶偶聯(lián)分光光度法進行初篩和復篩，獲得一株產酶活性及穩(wěn)定性良好的菌株BacillusfastidiosusZ7，其尿酸氧化酶酶活高達673.7 U/mg，可為尿酸氧化酶的工業(yè)化生產提供原始材料。Cheng等[6]從老芭蕉園、檳榔谷、玉米地等特殊生境中采集土壤樣品，采用苧麻富集培養(yǎng)，利用果膠平板水解圈法獲得具有脫膠功能的菌株Bacilluscereus1-1，發(fā)酵處理10 h的苧麻和紅麻失重率分別為27.9%和23.8%，其膠質去除效果達到或接近現有高效菌株DCE01。

1.2 菌種改良

從自然界篩選出的天然菌株往往活性、耐受性比較差，不能直接滿足工業(yè)化生產的要求。為了加快微生物的生長速度，提高產酶能力，可從細胞遺傳學和分子遺傳學角度改良菌種。Yang等[7]報道Bacillusalcalophilus的堿性淀粉酶基因在B.subtilis中過量表達，使堿性果膠酶產量提高76倍。杜海英等[8]采用紫外線誘變和60Co-γ射線協(xié)同誘變的方法，對黑曲霉Uco-3的原生質體進行誘變處理，獲得產高溫乳糖酶的高產突變株，其產乳糖酶活力達44.37 U/mL，是出發(fā)菌株的2.73倍。Chirumamilla等[9]利用突變技術(易錯PCR、DNA改組、點突變等)可改變酶的底物特異性、活性、對應選擇性和熱穩(wěn)定性等特點，使酶向適宜工業(yè)化應用的特征定向進化。趙天惠等[10]采用脈沖強光對B.subtilis進行誘變處理，獲得兼具高溫耐受、強酸耐受和高濃度膽鹽耐受性變異菌株B3和B7，產蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶活力分別比原始菌株提高了56%和71%、67%和77%、34%和42%，變異菌株產酶穩(wěn)定性較高，可遺傳變異。朱運平等[11]采用常溫、常壓等離子體誘變(ARTP)對產葡萄糖氧化酶的黑曲霉1504 菌株進行誘變育種，獲得的2 株菌株A117和A158的產酶活力提高至原始菌株的3.17 倍和3.31倍，分別達到172.72、180.74 U/mL。微生物菌種改良涉及重組DNA技術、原生質體融合和點突變技術等，通過增加酶基因的拷貝數或改變基因的特殊位點，以期提高表達酶的活力和改良酶的特性，使酶向適宜工業(yè)化目標定向改造。

2 微生物酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1 發(fā)酵方式選擇

在微生物酶的工業(yè)生產過程中，發(fā)酵是菌種產酶的重要環(huán)節(jié)。發(fā)酵方式主要有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種形式。細菌產酶通常是用液體深層培養(yǎng)發(fā)酵，而真菌產酶則更適于采用固體培養(yǎng)法生產，固體培養(yǎng)具有不易污染、容易管理、節(jié)省能源、單位容積產量高等優(yōu)勢。對常見的果膠酶工業(yè)生產而言，固體培養(yǎng)的生產成本低，培養(yǎng)物易于分離，在果膠酶工業(yè)化生產中占主導地位。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

微生物發(fā)酵產酶與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分(碳源、氮源、無機鹽等)和發(fā)酵外界條件(初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等)相關。液體發(fā)酵通常采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等作為基礎營養(yǎng)物，再針對具體的工業(yè)酶種類輔以合適的誘導物；固體發(fā)酵則以麩皮、豆粕、稻草等植物秸稈、橘皮、香蕉皮等工農業(yè)廢棄物為主要原料。成莉鳳等[12]通過優(yōu)化B.subtilisBE-91產胞外β-甘露聚糖酶的搖瓶發(fā)酵條件，獲得了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方：0.9%魔芋精粉、0.4%大豆蛋白、0.1% (NH4)2SO4、0.5% NaCl，在魔芋精粉的誘導下，β-甘露聚糖酶活力最高達432.4 IU/mL，比優(yōu)化前提高了40%。馮志彬等[13]分離并獲得一株具有較高L-天冬氨酸α-脫羧酶分泌能力的BacillustequilensisPanD37，經發(fā)酵條件優(yōu)化后L-天冬氨酸α-脫羧酶活力可達44.57 U/mL，比優(yōu)化前提高2.57倍，有望應用于β-丙氨酸的工業(yè)生產。根據微生物的生長與代謝規(guī)律，一般前期主要是微生物菌體迅速生長繁殖，穩(wěn)定期后，微生物產酶才能達到高峰。Apastambh等[14]對黑曲霉在30 L攪拌通氣發(fā)酵罐中的生長及產酶模式進行了研究，發(fā)現酶的合成主要發(fā)生在兩個階段，第一階段與菌體生長相關，在菌體達到對數生長期時結束；第二階段與菌體生長不相關，發(fā)生在分解代謝阻遏的結束期。

3 微生物酶的后處理工藝選擇

微生物酶的后處理工藝大致包括3個階段：酶的釋放和粗分離、提純提取和精細分離。為了獲得最大純化倍數和回收率，需要結合不同機制分離單元的提純方法組成一套工藝，提純方法的次序選擇至關重要，其選擇原則包括：集成不同分離原理的方法組合成整套工藝；優(yōu)先采用高效的分離方法去除含量高的雜質；最后采用價格昂貴、費時的分離方法[15]。優(yōu)化的工藝組合不僅能獲得較高的純化倍數和回收率，而且工藝簡化，更換較少條件即可使各步驟有機銜接。

3.1 沉淀

微生物酶在溶液中的穩(wěn)定性與分子大小、帶電荷量和水化作用有關，改變外界環(huán)境條件會影響酶蛋白的穩(wěn)定性，使酶蛋白沉淀析出。發(fā)酵液通過離心或過濾的方式去除菌體細胞，上清液可用超濾、(NH4)2SO4沉淀或有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮等)抽提等方法進行初步濃縮和分離。胞內酶先進行細胞破壁，再采用(NH4)2SO4沉淀和濃縮，也可采用梯度濃度的乙醇或丙酮分級沉淀。韋榮霞等[16]用20%～50%硫酸銨分級鹽析曲霉RSD發(fā)酵液中的生淀粉糖化酶，獲得比酶活力為185.43 U/mg，純化倍數為2.29，回收率為75.4%；蘇明慧等[17]用45%～65%乙醇分級沉淀來源于短短芽孢桿菌FM4B發(fā)酵液的幾丁質酶，獲得比酶活力為105.85 U/mg，純化倍數為1.74，回收率為73.1%。最常用的微生物酶分離采用(NH4)2SO4分級沉淀，因為硫酸銨具有溶解度大、對溫度變化不敏感、分級效果好等優(yōu)勢。

3.2 膜分離

膜分離作為一種新興的高效分離濃縮技術，由于兼有分離、濃縮、純化和精制的功能已廣泛應用于工業(yè)酶的大規(guī)模生產。與常規(guī)方法相比，膜分離能節(jié)約化學試劑，縮短分離周期，且能大幅度提高酶的濃縮倍數和回收率，是一種適用于微生物工業(yè)酶提取的高效和經濟的物理分離方法[18]。程小飛等[19]對粗酶液預處理，再進行超濾，使溴過氧化物酶比活達212 U/mg，純化了21倍，酶活回收率為96%。陸俊等[20]研究了中空纖維超濾膜分離提純大蒜超氧化物歧化酶的工藝參數，對酶液先后進行超濾和納濾處理，在最佳分離條件下，SOD單位酶活力達33.31 U/mL，比活力30.04 U/mg，回收率51.02%。

在發(fā)酵液后處理過程中采用膜分離技術可以除雜，加速酶的復性。微濾、納濾和超濾膜均適用于該加工過程(見表1)[21]。發(fā)酵液后處理過程中采用超濾和納濾，能使反應器內的底物和酶維持結合狀態(tài)，有利于去除抑制反應的組分[22]。采用膜過濾技術的優(yōu)點主要如下：省時省工；成本低；高溫下可操作，能源利用率高；可針對具體產品要求設計工藝；較分批發(fā)酵而言，更適用于連續(xù)發(fā)酵。

表1 常見膜分離過程特性

Table1 Common characteristic of membrane separation processes

種 類分離機制分離物大小結 構組 件材 料微濾以壓力為驅動力,主要依靠機械篩分作用可濾除大于50 nm的顆粒對稱高分子膜褶疊式、膜片式、纏繞式等聚氯乙烯膜、再生纖維素膜、聚丙烯膜、聚酰胺、聚四氯乙烯、陶瓷和不銹鋼等超濾以壓力為驅動力,主要依靠機械篩分作用可濾除5～100 nm的顆粒非對稱多孔膜中空纖維、平板式、管式等聚砜、醋酸纖維素、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺和陶瓷等納濾以壓力為驅動力,主要依靠溶解擴散效應低分子有機物的脫鹽純化非對稱膜和復合膜卷式、平板式和管式聚砜、醋酸纖維素和芳香族聚酰胺復合材料等

3.3 層析

酶的常規(guī)分離純化方法有凝膠過濾層析、親水層析、疏水層析等(見表2)[15]。單一的層析方法難以達到理想的分離效果，實際應用中常聯(lián)合幾種層析方法，或者結合其他不同原理的分離方法。離子交換、疏水層析和親和層析會使酶蛋白質濃縮, 而凝膠過濾色譜會使樣品稀釋。在離子交換層析后進行疏水層析，不需置換緩沖液，因為多數酶蛋白在高離子強度下與疏水介質結合能力較強，最后進行凝膠過濾層析又可直接換成合適的緩沖體系以利于酶蛋白產品成型保存。劉艷如等[23]結合陰離子交換層析和凝膠層析分離Burkholderiasp. ZYB002 胞外脂肪酶，獲得比酶活力為1902.5 U/mg，純化倍數為8.98，回收率為11.36%。李曄等[24]結合硫酸銨分級沉淀、Butyl FF 疏水層析及Superdex TM 200凝膠過濾層析等方法對BacilluscereusR75E菌株分泌的膠原酶進行后處理，獲得了純度高于90%的膠原酶，其比活力達到8.289 U/mg，純化倍數達到18.4倍。

表2 微生物酶的層析純化技術

Table 2 Chromatography technology used in microbial enzymes

方 法技術原理特 點用 途凝膠層析分子大小 分辨率適中;分級分離時流速較慢;脫鹽時流速快,容量受樣品體積限制適用于純化的后期階段,脫鹽可用于任何階段,特別是步驟銜接時的緩沖液更換離子交換電荷 分辨率較高;視支持物不同流速可很快;容量很大,不受樣品體積限制最適用于大體積樣品且蛋白純度較低的樣品早期純化,可分批操作疏水層析疏水極性 分辨率較高;流速快;容量很大,不受樣品體積限制適用于純化的任何階段,特別適用于離子強度較高的樣品,如沉淀、離子交換后的樣品親和層析生物親和性分辨率極高;流速很快;容量視配體可大可小,不受樣品體積限制適用于純化的任何階段,特別是樣品濃度小、雜質含量多時,可以減少純化步驟聚焦層析等電點 分辨率較高;流速快;容量大,不受樣品體積限制最適用于純化的最后階段

3.4 電泳

電泳是荷電溶質(電解質)或粒子在電場作用下發(fā)生定向泳動的現象，是分離酶蛋白和鑒定酶純度的重要方法。常見的電泳法有十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和等電聚焦電泳(IFE)。嚴芬等[25]采用DEAE-650C弱陰離子交換層析、CM-650M弱陽離子交換層析、Sephacryl S-200 凝膠層析和Octyl Sepharose CL-4B疏水層析等組合處理工藝，從綠色木霉M1 發(fā)酵液中分離純化得到4個電泳純的內切葡聚糖酶組分(EG1、EG2、EG3 和EG4)，分子量分別為25.4、28.8、56.3、60.5 kD。王強[26]對B.subtilisQ1發(fā)酵液中的葡甘聚糖酶用硫酸銨沉淀、透析、超濾離心和Sephadex G-100凝膠過濾層析，獲得電泳純酶。

4 微生物酶的優(yōu)勢與工業(yè)化應用

與植物酶和動物酶相比，微生物酶更適合工業(yè)化生產，其主要有以下優(yōu)勢：可大規(guī)模發(fā)酵生產，且簡便、經濟；提取和純化工藝簡單，酶回收率高；能夠在有限的空間和時間周期內，在不同的環(huán)境條件下產生多種酶；可進行基因操作，易獲得更高產量的酶。

微生物酶已廣泛應用于皮革、食品、紡織品、化妝品、洗滌劑和藥品等工業(yè)領域。在制藥工業(yè)，微生物酶可以合成抗生素、治療皮膚潰瘍、用于消化系統(tǒng)病癥的治療等[27]；在飼料工業(yè)，微生物酶能顯著提高動物平均體重和生產性能[28]；在烘焙領域，葡萄糖氧化酶可以有效提高面團工藝性能和面包質量并延長面包保鮮期[29]；在乳制品行業(yè)，微生物酶可作為添加劑，解決乳制品的結晶問題[30-31]；在紡織工業(yè)，纖維素酶可精煉纖維使植物纖維更易染色等[32-34]。

5 展望

天然微生物酶沒有得到充分發(fā)掘與利用，如何利用好自然界微生物這個巨大的酶寶庫是值得關注的焦點。因此，篩選與改良高產微生物酶的菌種、開發(fā)簡便高效的發(fā)酵工藝和 “綠色、環(huán)保”的分離純化工藝是微生物工業(yè)酶后處理的關鍵環(huán)節(jié)。

微生物酶的后處理工藝與發(fā)酵條件有關，培養(yǎng)介質的性質、消泡劑、菌齡等均可不同程度地影響發(fā)酵液中目標酶的后續(xù)回收工藝。與層析法相比，沉淀法受非蛋白質雜質干擾的程度較小，且能獲得大量目標酶。此外，應用現代膜分離技術可大幅度提高工業(yè)酶下游處理的總回收率、比酶活力和純度等關鍵參數，被認為是能替代化學方法的一種高效節(jié)能、環(huán)境友好的工藝。