宋鑫玲，曹洪勛，孫宇峰，王曉楠，夏尊民

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

種間雜交是育種工作者創(chuàng)造新變異的重要手段，種間雜交技術(shù)不僅能創(chuàng)新種質(zhì)資源，而且能夠拓寬種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)，豐富遺傳背景。通常情況下，同一作物同一屬、不同種之間雜交會出現(xiàn)不親和的現(xiàn)象，表現(xiàn)為種間雜交結(jié)實率降低、不結(jié)實、種子干癟、種子不能萌發(fā)、幼胚敗育等現(xiàn)象，很難得到完整種子?；谝陨蠁栴}周光宇等[1]首次提出利用花粉管通道技術(shù)打破種間雜交不親和的障礙?；ǚ酃芡ǖ兰夹g(shù)是利用自然授粉之后能發(fā)出花粉管，外源DNA直接經(jīng)花粉管進(jìn)入子房而實現(xiàn)與染色體配對交換的過程。這一技術(shù)已在玉米[2]、水稻[3]、小麥[4]等作物實現(xiàn)了應(yīng)用，并得到了豐富變異的導(dǎo)入后代。王玉富等[5]首次將這一技術(shù)應(yīng)用于亞麻育種上，并獲得亞麻新品種黑亞14號。由于外源DNA導(dǎo)入后代中僅有一部分是真正的導(dǎo)入后代，而哪些是真正的變異材料，需要開展科學(xué)規(guī)范的鑒定，因此，采用一定的方法將后代中真正的雜交變異材料篩選出來十分必要。

目前常用的技術(shù)有AFLP、RAPD、SSR、SNP等。前人對于外源DNA導(dǎo)入后代真實性鑒定的研究鮮有報道，張麗麗等[6]采用SSR技術(shù)對宿根亞麻與栽培亞麻雜交的后代進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交后代中僅有1株為真正的雜交種。由于作物遺傳變異是以性狀變異為單位，一個性狀可能由單基因控制，也可能由多基因控制，而且外源DNA導(dǎo)入后代的變異是多方向的[7]，故而本試驗擬采用RAPD技術(shù)對后代進(jìn)行鑒定，利用特異性引物對參試的后代群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出后代群體中出現(xiàn)供體條帶的個體，計算導(dǎo)入率，旨在為創(chuàng)新種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用野亞麻為供體材料，Viking為受體材料，隨機(jī)取130個個體作為導(dǎo)入后代參試群體，RAPD引物10個，2 × Taq Master Mix (Dye Plus)，ddH2O，Argorse(瓊脂糖)，1×TAE，EB(溴化乙錠)，DL2000 bp DNA Marker，DL15000 bp DNA Marker。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞麻種子DNA提取

試驗采用改良的高鹽低pH值法[8]，提取供體、受體、參試群體種子的總DNA，采用超微量分光光度計及瓊脂糖檢測純度及條帶的完整性。

1.2.2 引物篩選

試驗采用李秋芝等[9]篩選的試驗引物10個，引物編號及序列見表1。

表1 10個RAPD引物編號及序列

Table 1 10 RAPD primer numbers and sequences

序號名稱序列序號名稱序列1S1047CCCTCCCTAA6S1353CCGCTCGTAA2S1230CCCGTCTACC7S2105CACCCCGAAA3S1238GTTGCGCAGT8SC07GTCCCGACGA4S1270GGCGTATGGT9SH04GGAAGTCGCC5S1314GGTTCTGCTC10ST09CACCCCTGAG

RAPD反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 12.5 μL+DNA模板2 μL+Primer 1 μL+無菌水4.5 μL。

PCR過程：94 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 1 min，36 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35次循環(huán)之后，72 ℃ 5 min延伸，4 ℃保持。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選供體與受體有差異的引物條帶。

1.2.3 群體鑒定

采用篩選得到的RAPD多態(tài)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇與供體具有相同條帶的個體。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻種子DNA提取效果及檢測結(jié)果分析

由圖1可知，提取的DNA產(chǎn)物在260 nm下有最大吸收峰，3次重復(fù)顯示的吸收峰較為一致。第3、5、6泳道檢測出明顯條帶，第5泳道濃度最大，提取的野亞麻DNA條帶完整清晰，無拖尾，片段大于1.5 kb，RNA消化比較干凈，其他泳道沒有檢測出條帶(見圖2)?；趥鹘y(tǒng)DNA提取亞麻種子的方法優(yōu)化一粒亞麻種子DNA提取技術(shù)，結(jié)果如圖3所示，可以看出微量DNA能夠檢測到完整條帶，通過與marker亮度比對，估算其濃度約為50 ng/uL，條帶片段大于1.5 kp，無降解，略有少量RNA，但不影響PCR反應(yīng)。

圖1 野亞麻DNA的超微量檢測Fig.1 Ultra-micro-detection of wild flax DNA

圖2 DNA大量提取的瓊脂糖電泳檢測Fig.2 Agarose electrophoresis detection of DNA extraction

圖3 DNA超微量提取的瓊脂糖檢測Fig.3 Detection of DNA ultra-micro extraction agarose

2.2 RAPD引物篩選結(jié)果分析

參試的10個引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得如下結(jié)果(見圖4、 5)，由圖4可知，引物S1314在受體Viking擴(kuò)增出一條介于250～500 bp的條帶，在供體野亞麻上擴(kuò)增出750 bp和500 bp兩條條帶，證明該引物在供體與受體之間具有多態(tài)性。從圖5可以看出，引物SH04在受體擴(kuò)增出一條250 bp的條帶，在供體擴(kuò)增出1000、750、500 bp以及介于500～750 bp和250～500 bp之間的5條條帶，因此證明該引物在供體與受體之間具有多態(tài)性。

圖4 特異引物S1314的篩選與條帶Fig.4 Screening and banding of specific primer S1314

圖5 特異性引物SH04篩選與條帶Fig.5 Specific primer SH04 screening and banding

2.3 導(dǎo)入后代群體真實雜交種的篩選

將Viking為受體的部分后代做鑒定，隨機(jī)抽取的后代個體經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得如下結(jié)果：參試的130個個體中，經(jīng)引物SH04擴(kuò)增后，有5個與供體一致的條帶，圖6顯示的是部分群體的PCR鑒定結(jié)果。從圖中可以看出，14號個體在引物SH04下共擴(kuò)增出7條帶，其中存在和供體與受體相同的條帶；17號個體擴(kuò)增出 7條帶，包含供體與受體的條帶；22號個體擴(kuò)增出6條帶，也同時包含供體與受體的條帶。圖7是經(jīng)過引物S1314篩選得到的14號個體，可見14號個體在引物S1314擴(kuò)增出 6條帶，包含供體和受體的條帶。證明上述個體為種間雜交種，導(dǎo)入率為1.3%。

圖6 引物SH04篩選出的差異個體Fig.6 Differential individuals screened by primer SH04

圖7 引物S1314篩選出的差異個體Fig.7 Differential individuals screened by primer S1314

3 討論

外源DNA導(dǎo)入對提取的DNA要求較高，研究[10]表明，DNA濃度對導(dǎo)入率影響差異顯著，濃度過低，導(dǎo)入率降低，濃度過高則DNA很難隨花粉管進(jìn)入子房，以250 ng/μL為適宜濃度。在野亞麻DNA提取過程中，由于野亞麻種皮含有大量的果膠質(zhì)，果膠作為一種多糖，與DNA分子屬耦合關(guān)系，很難與其分離，傳統(tǒng)的CTAB法提取的DNA粘度很大，可采用分光光度計檢測其濃度，但瓊脂糖凝膠電泳無法跑出完整條帶。本試驗中提取緩沖液為酸性，可將DNA-果膠最大程度釋放，經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾可去除大部分果膠質(zhì)，再用酸性醋酸鉀去除雜質(zhì)，便可得到大量的DNA，溶液的粘度幾乎為零，最高濃度1200 ng/μL。在此研究基礎(chǔ)上，同時實現(xiàn)了一粒亞麻種子DNA的超微量提取，濃度約為50 ng/μL，條帶清晰完整，滿足PCR的基本需求。

采用外源DNA導(dǎo)入技術(shù)獲得的后代中，有一部分是真正的雜交后代，大部分是自花授粉的后代。前人[11]采用具有明顯差異的供體受體為研究對象，通過田間篩選選出后代中具有受體性狀的植株。王黎明等[12]采用同工酶法研究高粱導(dǎo)入外源DNA后的同工酶譜的變化，發(fā)現(xiàn)酶譜出現(xiàn)增加或減少的現(xiàn)象，說明有部分基因整合到了受體DNA上。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，可以從基因水平鑒定后代中是否有供體條帶出現(xiàn)以及基因片段的大小。本試驗在引物篩選中獲得了兩個RAPD多態(tài)性引物，分別是S01314和SH04。參試的130個個體經(jīng)SH04引物篩選得到個體14號、17號、22號、84號和105號具有差異性的條帶。經(jīng)引物S1314篩選得到個體14號具有差異性條帶。在本試驗中外源DNA導(dǎo)入率為3.8%，這一結(jié)果與周光宇[13]的研究結(jié)果相一致。本試驗中篩選的5個差異個體中均有受體條帶的出現(xiàn)，這些片段與供體的DNA發(fā)生整合，說明外源DNA導(dǎo)入法在野生資源利用方面具有重要價值，發(fā)生基因整合的個體可以通過田間表型來觀測變異的方向，同時擴(kuò)增出的基因片段可以用來測序，進(jìn)一步開展變異基因的功能等研究。

種間雜交的最終目的是創(chuàng)造新變異材料，最終形成品種，而新品種的鑒定技術(shù)與方法具有多樣性[14]。RAPD技術(shù)并不是唯一的檢測手段，變異株的形態(tài)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)性狀的變異仍需在大田或盆栽中進(jìn)行，觀察活體植株的變異，下一步將圍繞導(dǎo)入后代的表型鑒定開展變異株DNA擴(kuò)增片段個體重測序，尋找有利變異基因。

4 結(jié)論

參試的10對引物中，具有特異性的引物2個，分別是S1314、SH04。參試的130個個體中有5個個體檢測出與供體具有相同的條帶，導(dǎo)入率為3.8%。