陳思，楊秀坤，王珣，李柱剛，楊帆，吳廣文，劉巖，金慧，周春薇，楊學(xué)*

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江省綏化市慶安縣歡勝鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，黑龍江 綏化 152461)

亞麻白粉病是由亞麻粉孢(OidiumliniSkoric)引起的一種世界性的真菌病害。在亞麻主要種植區(qū)，白粉病均有發(fā)生[1-3]，且日趨嚴重，對亞麻種子及纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴重的威脅[4-5]，培育抗病品種是解決該問題的關(guān)鍵。采用生物技術(shù)的分子育種相比于傳統(tǒng)的育種手段，具有快捷、準確、外界因素難以干擾等優(yōu)點，能夠極大加速目標基因的確定和利用，較早淘汰不利相關(guān)性狀，從而達到縮短育種周期，提高育種效率的目的。

基因表達系列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)技術(shù)不僅可以在較短的時間內(nèi)對細胞中近乎全部的mRNA進行檢測，而且可以定量分析這些mRNA的表達拷貝數(shù)，同時能使?jié)撛诘奈粗虻靡园l(fā)現(xiàn)[6]，該技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用對細胞基因表達頻譜方面的研究具有重要意義。該項技術(shù)是以寡核苷酸序列標簽(tag)對mRNA轉(zhuǎn)錄物進行特異性地確定，然后將多個標簽(20～60個)用連接酶隨機串聯(lián)起來形成多個多聯(lián)體(concatemer)，再將其克隆到載體中，隨后對全部克隆進行測序，其中標簽來自于轉(zhuǎn)錄子(cDNA)上的特定區(qū)域，大小為9～14 bp。經(jīng)SAGE軟件分析，可使表達的基因種類得以確定，此外標簽出現(xiàn)的頻率能夠反映出基因的表達豐度，進而構(gòu)建SAGE文庫。對在特異組織中表達的差異基因或是在各種脅迫條件下表達的差異基因進行分析時，SAGE是一種非常有效的方法，因而在植物抗逆性研究方面得到了一定的應(yīng)用。Matsumara等[7]將SAGE技術(shù)應(yīng)用到稻瘟病菌侵染后水稻基因表達情況的研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病原菌細胞壁提取物能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗真菌蛋白質(zhì)以及與防御信號傳導(dǎo)可能存在相關(guān)性的一些基因，與此同時還發(fā)現(xiàn)了可能參與細胞凋亡過程的基因。Mitchell等[8]為了解與寄主抗性和病原菌致病力相關(guān)的基因，采用SAGE方法對水稻與稻瘟病菌之間相互識別及病理反應(yīng)開展全基因組分析，最終獲得包含水稻和稻瘟病菌基因互作的400多個微列陣芯片并得以應(yīng)用。Gowda等[9]為了獲得基因表達譜以及確定新的抗性基因，將LongSAGE新方法應(yīng)用于水稻和稻瘟病菌互作過程中基因表達的綜合分析。Mysore等[10]將番茄轉(zhuǎn)錄因子Pti4(Pto互作蛋白)在模式植物擬南芥中表達，根據(jù)SAGE方法對受Pti4因子調(diào)節(jié)的基因進行了鑒定。Portieles等[11]利用SuperSAGE和第二代測序技術(shù)構(gòu)建了煙草與立枯絲核菌互作過程的轉(zhuǎn)錄組文庫，并分別獲得了8960個上調(diào)和8221個下調(diào)的差異標簽。通過前人的研究結(jié)果可以看出，植物的抗病性與植物本身以及病原物的基因均有關(guān)，對這些基因客觀、正確的認識，對在基因角度了解植物抗病性非常重要。SAGE技術(shù)在不斷改良和創(chuàng)新，在原SAGE基礎(chǔ)上的新技術(shù)LongSAGE，既可以在短時間內(nèi)對新基因和外顯子加以鑒定，又可以在大量的基因表達分析和基因組的注釋方面有突出表現(xiàn)[12]。目前該技術(shù)在昆蟲的基因表達分析中應(yīng)用也較為廣泛[13-15]。

SAGE技術(shù)建立在兩個基本原理之上，一是在一個轉(zhuǎn)錄體系中，每種轉(zhuǎn)錄本都可以用一個特異的固定長度寡核苷酸序列(9～l6 bp)來代表，這些短序列稱為SAGE標簽(SAGEtag)，通過一定的試驗步驟，可將這些標簽從cDNA中分離出來制備成一個SAGE標簽庫，然后連接成標簽多聚體進行克隆測序；二是每種標簽在全部標簽中所占的比例可以反映其所代表的轉(zhuǎn)錄本在整個轉(zhuǎn)錄體系中的表達豐度。因此本SAGE標簽數(shù)據(jù)庫中具有顯著差異表達豐度的轉(zhuǎn)錄組即代表了抗白粉病性狀相關(guān)的表達基因(轉(zhuǎn)錄組)。利用SAGE技術(shù)分析基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，開展亞麻抗病育種，能夠縮短抗源篩選和抗性基因鑒定的時間，使抗性基因的合理利用得以加快，并且能夠盡快地在同一優(yōu)良品種中聚合到多種抗病基因。目前，國內(nèi)外對于亞麻白粉病的致病機制還沒有進一步的研究。本研究參照其他農(nóng)作物基因表達系列分析的研究，利用SAGE技術(shù)對亞麻抗白粉病材料(9801-1)進行分析，獲得I-SAGE標簽庫，旨在為今后高抗白粉病育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從黑亞11號田間自然變異突變體選育出亞麻抗白粉病材料9801-1，對亞麻白粉病的抗性遺傳進行了分析，證實了黑亞11號田間自然變異突變體(9801-1)對白粉病的抗性屬于顯性單基因遺傳[16]。本研究以亞麻抗白粉病材料9801-1及其感病對照黑亞11號為基礎(chǔ)建立了亞麻抗白粉病SAGE標簽數(shù)據(jù)庫。將供試材料播種于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院民主試驗園區(qū)中，于亞麻快速生長期將溫室內(nèi)用亞麻活體繁殖的病原菌移置田間，使其分生孢子自然接種到供試材料上，待充分發(fā)病時取樣，后立即用液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 mRNA的分離

采用Trizol試劑總RNA提取試劑盒(Catalog no.K15596-026)提取RNA，提取后的RNA樣品適當稀釋后，用紫外分光光度計檢測RNA的純度，記錄OD260/OD280值，并用常規(guī)1%瓊脂糖凝膠進行瓊脂糖溴化乙錠電泳檢測RNA完整性。mRNA的分離純化采用美國Qiagen公司的Oligotex?mRNAMi-di試劑盒，具體操作步驟見試劑盒說明書。

1.3 SAGE庫的構(gòu)建

SAGE庫的構(gòu)建采用In-vitrogen公司的I-SAGETMLONG試劑盒，具體操作步驟簡要描述如下：用生物素標記的oligo dT為引物將所得的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用限制性內(nèi)切酶NlaⅢ(錨定酶anchoring enzyme，AE)酶切，然后采用鏈霉素親和性磁珠收集cDNA 3′端部分；用NlaIII消化cDNA后，將收集的cDNA分為兩部分，分別用T4DNA連接酶連接一個cDNA池到LS接頭A，連接另一個cDNA池到LS接頭B，每一種接頭都含有IIS類型限制酶MmeI(標簽酶tagging enzyme，TE)的識別位點；用MmeI酶切產(chǎn)生連有接頭的短cDNA片段，混合兩種不同接頭的cDNA片段，構(gòu)成雙標簽后，以接頭上的引物進行PCR擴增；最后用錨定酶酶切擴增產(chǎn)物抽提雙標簽片段，用T4DNA連接酶連接雙標簽，并進行克隆、測序。詳細操作見試劑盒說明書。

1.4 文庫標簽數(shù)量的計算

每個克隆標簽的總數(shù)=插入片斷的大小/17(標簽的大小)

每個克隆標簽的總數(shù)×克隆的數(shù)量/μL =標簽總數(shù)/μL

根據(jù)34 bp雙標簽串聯(lián)體的平均大小以及克隆的數(shù)量可以大致估算出I-SAGE標簽庫的標簽數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA合成效率

用常規(guī)1%瓊脂糖凝膠進行瓊脂糖溴化乙錠電泳檢測cDNA合成效率，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在以亞麻合成cDNA為模板的泳道上出現(xiàn)1條清晰的350 bp條帶，證實cDNA合成成功并且合成效率可以滿足試驗要求。

注：1-泳道100 bp ladder；2、3-以亞麻抗病材料9801-1及其感病對照總RNA合成的cDNA為模板配合其特異性引物的PCR產(chǎn)物；4-陰性對照；5-以血液細胞總RNA合成的cDNA為模板配合其特異性引物的PCR產(chǎn)物。

2.2 130 bp雙標簽產(chǎn)量控制及凝膠純化

PCR后，取稀釋至10%的樣品于4%瓊脂糖凝膠上樣進行瓊脂糖溴化乙錠電泳，檢測130 bp雙標簽Nla III消化結(jié)果(見圖2)。通過在凝膠成像下比較雙標簽和LS對照模板的濃度來確定雙標簽的產(chǎn)量，也可以用低分子量DNA ladder鑒定雙標簽的產(chǎn)量。通常需要20～200 μg的雙標簽用于下一步反應(yīng)，實施大規(guī)模PCR擴增獲得理想的產(chǎn)量。從圖2可以看到清晰的130 bp的雙標簽帶和一個微弱的100 bp條帶(僅含有接頭序列，沒有轉(zhuǎn)錄序列)。以1∶40稀釋比例，27～30個循環(huán)即能得到較好結(jié)果。將PCR后的130 bp雙標簽產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，經(jīng)凝膠洗脫親和層析柱純化后用于下一步反應(yīng)。

注：1、7-100 bp ladder；2-不含模板的陰性對照；3-不含連接的陰性對照；

2.3 34 bp雙標簽的純化及串聯(lián)體的形成

凝膠純化后的130 bp雙標簽經(jīng)Nla III消化后得到34 bp條帶，將34 bp雙標簽經(jīng)凝膠洗脫親和層析柱純化(見圖3)。將所有樣品點到2%瓊脂糖凝膠的一個點樣孔中后開始電泳，當溴酚藍前沿到底部3/4處結(jié)束電泳。將凝膠置于0.5～2 μg/mL溴化乙錠中染色，紫外燈下觀察條帶，可見彌散的約100 bp到1 kb條帶，結(jié)果如圖4。將300～500 bp、500～800 bp、800～1000 bp的產(chǎn)物切下，經(jīng)凝膠洗脫親和層析柱純化用于下一步克隆反應(yīng)。

注：M-Marker；1-雙標簽。

圖3 凝膠純化34 bp雙標簽Fig.3 Gel-purifying of the 34 bp ditag

注：M-100 bp ladder；1-串聯(lián)體。

2.4 I-SAGE標簽的計算

在I-SAGE標簽庫中75%以上的克隆應(yīng)大于400 bp(陰性為200 bp)，I-SAGE標簽庫的數(shù)量決定于產(chǎn)物包含大插入片斷的百分比。

根據(jù)34 bp雙標簽串聯(lián)體的平均大小以及克隆的數(shù)量估算I-SAGE標簽庫的數(shù)量：

亞麻抗病材料9801-1 I-SAGE標簽庫的數(shù)量=700(平均串聯(lián)體的大小)/17 × 496(克隆的數(shù)量)=20423

亞麻感病對照I-SAGE標簽庫的數(shù)量=700(平均串聯(lián)體的大小)/17 × 532(克隆的數(shù)量)=21905

3 結(jié)論與討論

SAGE是基因表達水平差異分析和大規(guī)模發(fā)現(xiàn)新基因的分子生物學(xué)技術(shù)[17-18]，作為一種高通量的表達基因檢測方案，SAGE獲得基因表達頻譜十分方便，是目前獲得特定組織的全部表達基因的最好方法。SAGE的特點是單一轉(zhuǎn)錄體由其特異性的短標簽所代替，標簽連接后組成的串聯(lián)體克隆到質(zhì)粒內(nèi)進行擴增后測序，標簽的豐度即代表某種轉(zhuǎn)錄體的水平。以21 bp的標簽代表某一mRNA為例，4種不同的堿基隨機組合，理論上應(yīng)能得到421(4398046511104)個標簽，而人類基因組預(yù)測的編碼基因在28642與153478之間[19]，因此足以涵蓋所有已知物種的基因，出現(xiàn)重復(fù)的幾率為0。

在凝膠成像下比較雙標簽和LS對照模板的濃度可以確定雙標簽的產(chǎn)量。通過比較雙標簽和LS對照模板特定稀釋濃度的強度來測定130 bp雙標簽的產(chǎn)量，如果130 bp雙標簽產(chǎn)量接近LS陽性對照模板的產(chǎn)量，需要至少200～300 個PCR反應(yīng)；如果130 bp雙標簽產(chǎn)量明顯少于LS陽性對照模版的產(chǎn)量，則需要至少400～600個PCR反應(yīng)。

本研究以亞麻抗白粉病品系9801-1及其感病對照黑亞11號為基礎(chǔ)，提取時間為接種白粉病菌后，感病品種發(fā)病而抗病品種未發(fā)病的時期，采用具有更高特異性的I-SAGETMLONG KIT，用一個特異的固定長度(21 bp)寡核苷酸序列(SAGE標簽)代表轉(zhuǎn)錄體系中的每種轉(zhuǎn)錄本，將這些標簽從cDNA中分離出來制備成一個數(shù)量在20000余個的SAGE標簽庫，試驗結(jié)果未來可以直接與SAGEmap表達數(shù)據(jù)庫中不同來源的數(shù)據(jù)相比較，并可將基因表達的數(shù)據(jù)保留下來，作為分析亞麻抗白粉病基因表達差異之用。通過對SAGE標簽數(shù)據(jù)庫中表達有明顯差異的標簽進行分析，有望找到一系列與亞麻抗白粉病性狀表達相關(guān)的基因，進而通過這些mRNA表達差異分析亞麻白粉病分子調(diào)控機制。根據(jù)文獻記載[20]，一個高質(zhì)量I-SAGE標簽庫產(chǎn)量達100000個標簽，本試驗產(chǎn)生標簽20000余個，明顯低于參考值，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因為亞麻的基因組總量偏低，mRNA數(shù)量本身就明顯低于參考物種(人類、水稻)。因此即使標簽的數(shù)量略少，仍能代表轉(zhuǎn)錄體的表達水平，用于準確定量分析標簽的豐度。

作為目前唯一以測序為基礎(chǔ)的定量分析全基因組表達模式的技術(shù)，SAGE技術(shù)在定量分析各轉(zhuǎn)錄子表達水平及檢測表達豐度等方面具有明顯優(yōu)勢。本研究建立的亞麻抗白粉病SAGE標簽數(shù)據(jù)庫將為亞麻抗白粉病研究的深入開展和應(yīng)用起到巨大的推動作用。