[摘要]目的 探討OPA相互作用蛋白5（OIP5）在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義。方法"選擇90例上皮性卵巢癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本，運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)OIP5的表達(dá)及細(xì)胞定位。結(jié)果"與癌旁正常組織相比，OIP5蛋白在卵巢癌組織中表達(dá)明顯升高（χ2=14.100，P<0.05），且其表達(dá)水平與卵巢癌的N分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后等顯著相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.000～10.106，P<0.05）。結(jié)論 OIP5在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著癌基因的作用。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤;OPA相互作用蛋白5;腫瘤轉(zhuǎn)移;預(yù)后;病理學(xué)，臨床

[中圖分類號(hào)]R737.31

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2019）05-0560-05

doi：10.11712/jms201905014

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

上皮性卵巢癌 （EOC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，占卵巢腫瘤的50%～70%。由于EOC早期 （Ⅰ、Ⅱ期）缺乏典型的臨床表觀，大約76%的病人在就診時(shí)往往處于癌癥晚期階段 （Ⅲ、Ⅳ期），發(fā)現(xiàn)時(shí)已有腹腔、肝、胸腔或顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和種植，這是導(dǎo)致EOC較高病死率的主要原因。目前，EOC的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人類基因組計(jì)劃已極大的豐富了人類對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)，各種實(shí)驗(yàn)平臺(tái)技術(shù)被用來發(fā)現(xiàn)和鑒定癌癥相關(guān)基因或者治療的靶標(biāo)。OPA相互作用蛋白5（OIP5）基因最初被鑒定為OPA互作蛋白5[1-3]。PAWLAK等[4]研究顯示，OIP5在一些腫瘤組織或者正常組織中均有表達(dá)。OIP5在細(xì)胞增殖的G1期或者細(xì)胞在靜止、衰老與分化完畢時(shí)呈上調(diào)表達(dá)[1];亦有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)中心體或著絲粒的結(jié)構(gòu)和功能是必要的，OIP5在細(xì)胞末期G1期的中心體上聚集，介導(dǎo)染色質(zhì)和細(xì)胞周期的調(diào)控[2]。目前相關(guān)研究結(jié)果表明，OIP5參與了胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、食管癌、腎透明細(xì)胞癌、急性髓樣白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳癌、肝癌和膀胱癌等疾病的發(fā)生和發(fā)展[5-13]。但OIP5在EOC組織中的表達(dá)目前尚未見有研究報(bào)道。為了明確OIP5在EOC中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)的相關(guān)性，本文研究運(yùn)用免疫組化技術(shù)對(duì)90例EOC及配對(duì)癌旁正常組織中的OIP5表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2010—2016年，我科診治EOC病人 90例，年齡46～83歲，中位年齡61.5歲。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì) （AJCC） 2016年第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[1]：Ⅰ期10例，Ⅱ期33例，Ⅲ期34例，Ⅳ期13例;T1+T2期34例，T3+T4期56例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例;遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移60例，無遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移30例;黏液型卵巢癌18例，漿液型卵巢癌46例，子宮內(nèi)膜型卵巢癌14例，卵巢移行細(xì)胞癌5例和卵巢透明細(xì)胞癌7例。本研究通過了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，病人均知情同意。

1.2 免疫組化方法

EOC組織切片于60 ℃烤箱中過夜后，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液水化后浸泡于蒸餾水中待用。OIP5蛋白采用檸檬酸進(jìn)行組織抗原修復(fù)：取200 mL修復(fù)緩沖液于耐高溫的修復(fù)盒，將脫蠟水化后的組織切片置于切片架上，放入緩沖液中，將修復(fù)盒放入微波爐中，調(diào)至解凍溫度，20 min后取出，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，每次5 min，之后再用磷酸鹽緩沖液（pH值7.2～7.4）沖洗2次，每次5 min。甩去PBS液后，每張切片加200 μL的兔抗人OIP5抗體（稀釋度1∶100，Abcam公司），放入濕盒內(nèi)，置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜。甩去PBS液，每張切片加200 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。甩去PBS液，每張切片加200 μL新鮮配制的DAB溶液，光學(xué)顯微鏡下控制顯色，并及時(shí)終止反應(yīng)。自來水沖洗，蘇木精復(fù)染20 s，用自來水沖洗30 min，使切片返藍(lán)。切片經(jīng)過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封固。以已知陽性的病例作為陽性對(duì)照，以正常兔IgG代替一抗作為免疫組化實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化評(píng)分

OIP5蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，均為棕黃色、棕褐色顆粒。陽性細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分：陽性表達(dá)細(xì)胞<5%為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，>50%為3分。陽性細(xì)胞表達(dá)染色強(qiáng)度評(píng)分：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合陽性細(xì)胞數(shù)比例和染色強(qiáng)度，以兩者之和為最后得分判斷：0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（），5～6分為強(qiáng)陽性（）。在低倍鏡（100倍）下觀察整張切片，隨機(jī)選擇4個(gè)高倍視野（200倍）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。最后以陰性和弱陽性表達(dá)為OIP5低表達(dá)組、中陽性和強(qiáng)陽性為OIP5高表達(dá)組進(jìn)行臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較用χ2檢驗(yàn)。生存資料單因素分析采用Kaplan-Meier法，差異的顯著性分析采用Log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OIP5在卵巢癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，OIP5陽性顆粒定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)/漿中。OIP5的表達(dá)具有高度的異質(zhì)性，其在腫瘤組織中的表達(dá)從陰性、弱陽性到中陽性表達(dá)。90例EOC組織中，OIP5陰性表達(dá)者18例，弱陽性表達(dá)者20例，中陽性表達(dá)者52例，未見強(qiáng)陽性表達(dá)。在正常組織中OIP5呈陰性表達(dá)的有73例，中陽性表達(dá)的有17例。與癌旁正常組織相比，OIP5在EOC組織中顯著性上調(diào)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.100，P<0.05）。見圖1。

2.2 OIP5高表達(dá)與EOC臨床病理特征的相關(guān)性

本文結(jié)果表明，OIP5的表達(dá)水平與N分期和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.000、8.221，P<0.05）。與其他臨床病理學(xué)參數(shù)，比如病人年齡、T分期、臨床分期、腫瘤大小和病理學(xué)分型等均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（Pgt;0.05）。值得注意的是，雖然OIP5的表達(dá)與病理學(xué)分型不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，但是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的趨勢(shì)（P=0.068）。即在黏液型、漿液型、子宮內(nèi)膜型及混合型卵巢癌組織中，OIP5蛋白在漿液型EOC組織中傾向性高表達(dá)。見表1。

2.3 OIP5表達(dá)與EOC病人預(yù)后的關(guān)系

本文90例EOC病人中，手術(shù)時(shí)間為2010—2016年，生存時(shí)間0.5～37.5個(gè)月，平均21.38個(gè)月。存活24例，死亡66例;OIP5高表達(dá)52例，低表達(dá)38例。Long-rank分析顯示，OIP5的表達(dá)與不良預(yù)后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相關(guān)性（χ2=10.106，Plt;0.01）。其表達(dá)水平越高，總生存率越低。見圖2。

3 討論

在本研究中，我們報(bào)道了OIP5在EOC組織中的表達(dá)水平及其臨床病理學(xué)意義。本文結(jié)果表明，OIP5在EOC組織中相比癌旁正常組織顯著性上調(diào);且OIP5表達(dá)與卵巢癌的N分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后等具有顯著相關(guān)性，提示OIP5可能參與了EOC的發(fā)生發(fā)展。

在惡性腫瘤中，最先開展OIP5的研究是在胃癌中，隨后陸續(xù)地在結(jié)直腸癌、肺癌、食管癌、腎透明細(xì)胞癌、急性髓樣白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳癌、肝癌和膀胱癌等中均發(fā)現(xiàn)OIP5呈上調(diào)表達(dá)[5-13]，這與本研究的結(jié)果是一致的。這些研究結(jié)果提示，OIP5在A為黏液型卵巢癌組織，B為漿液型卵巢癌組織，C為子宮內(nèi)膜型卵巢癌組織，D為正常卵巢組織。A、B、C表示OIP5中陽性表達(dá);B1表示弱陽性表達(dá);B2、D表示陰性表達(dá)或不表達(dá)。圖中比例尺為200 μm。

惡性腫瘤中可能是一個(gè)癌基因，參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展及惡性表型。CHUN等[6]運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)66例結(jié)腸癌組織和9例正常組織的檢測(cè)結(jié)果顯示，OIP5在腫瘤組織中的表達(dá)是其在正常組織的3.7倍;但是OIP5的表達(dá)與臨床分期（Ⅱ期和Ⅲ期之間）和復(fù)發(fā)與否（復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)之間）均無顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果與其一致，這說明OIP5的表達(dá)不太可能作為EOC臨床分期的一個(gè)潛在標(biāo)志物。KOINUMA等[7]在336例非小細(xì)胞性肺癌和305例食管鱗癌中分析OIP5表達(dá)的臨床病理學(xué)意義，結(jié)果顯示，OIP5的表達(dá)與非小細(xì)胞性肺癌和食管鱗癌的預(yù)后均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。并且通過多因素分析確認(rèn)了OIP5的表達(dá)在非小細(xì)胞性肺癌中是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。本研究結(jié)果與其基本一致。由于本研究未進(jìn)行多因素分析，因而無法得出OIP5的表達(dá)水平是否在EOC中是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。因此，這需要在后續(xù)研究中用較大樣本進(jìn)行確認(rèn)。GONG等[8]運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)OIP5在腎透明細(xì)胞癌表達(dá)的結(jié)果表明，其表達(dá)不僅與T分期、N分期和臨床分期有關(guān)，而且多因素分析顯示OIP5還是腎透明細(xì)胞癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。這與我們的研究有所不同。本研究結(jié)果未顯示，OIP5的表達(dá)與T分期和臨床分期無顯著相關(guān)性。其差異可能與使用的抗體不同或者使用的組織標(biāo)本不同有關(guān)。OIP5已被證實(shí)為是一種組織特異性基因，其表達(dá)具有一定的組織特異性[5]。此外，OIP5在膀胱癌中亦被鑒定為發(fā)揮著癌基因的作用[13]。在乳癌中OIP5被發(fā)現(xiàn)除了介導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)之外，在調(diào)控細(xì)胞周期及有絲分裂中正常染色體分離等方面起著重要的作用[11]。盡管如此，有關(guān)OIP5的分子機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中OIP5參與了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，該作用是通過miR-15-5p調(diào)控OIP5來完成的[12]。在乳癌中OIP5是通過miR-139-5p/NOTCH1通路而起作用的[16]。OIP5在EOC中的作用機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。由于其機(jī)制研究離不開體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在本研究中我們未能開展體外EOC細(xì)胞系培養(yǎng)工作，因而有關(guān)其具體的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)制尚不明確，需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究探討。此外，在我們的研究中，仍有兩點(diǎn)需要注意。首先，由于免疫組化的評(píng)分有較大的主觀性，因此免疫組化的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)潛在地影響最終統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。其次，鑒于OIP5在EOC組織中表達(dá)的高度異質(zhì)性，在本研究中我們只使用了一種實(shí)驗(yàn)方法探討OIP5在卵巢癌組織中的表達(dá)或許不夠充分。免疫印跡或者實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可能是免疫組化的一個(gè)強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證或補(bǔ)充。

總之，本研究結(jié)果顯示EOC組織中OIP5表達(dá)顯著上調(diào);上調(diào)表達(dá)的OIP5與卵巢癌的N分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后等顯著相關(guān)，提示OIP5可能參與了EOC的發(fā)生發(fā)展。鑒于本研究的樣本例數(shù)有限，因而有必要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行多中心大樣本的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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（本文編輯 于國(guó)藝）