冉軍艦，梁新紅，陳曉靜，李向陽，焦凌霞，趙瑞香,*

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新鄉(xiāng)市農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院后勤管理處，河南 新鄉(xiāng) 453003）

根皮苷是蘋果中的特征酚類物質(zhì)，是蘋果多酚中最具有代表性的一種多酚，屬于植物黃酮類中的二氫查耳酮苷，在不同品種中差異較大[1]，對蘋果的風(fēng)味和色澤有重要的作用[2-4]，根皮苷也是功能活性最顯著的多酚[5]，已經(jīng)證明根皮苷具有多種生物活性，如可調(diào)節(jié)血壓、降低血糖、清除體內(nèi)自由基、保護(hù)心臟、預(yù)防和治療糖尿病等[6-8]。根皮苷可以作為蘋果幼芽和成熟芽之間轉(zhuǎn)變的多酚指示物[9]。蘋果根滲出液中的根皮苷可以作為能引起蘋果再植病害的微生物的一個宿主識別信號[10]。作為一個糖類運(yùn)輸?shù)母偁幮砸种苿?，根皮苷能降低葡萄糖?-O-甲基葡萄糖、蔗糖的攝取量[11]。

關(guān)于根皮苷的功能研究內(nèi)容已經(jīng)很多，作用機(jī)理也比較清楚。但是對于根皮苷在蘋果果實(shí)內(nèi)的合成中，催化物質(zhì)之間轉(zhuǎn)化的酶類研究較少，遠(yuǎn)沒有達(dá)到像花青素[12-15]那樣的深度和廣度。根皮苷生物合成過程分別是對香豆酰輔酶A通過脫氫酶催化生成4-羥基二氫肉桂酰輔酶A，然候再由查耳酮合酶催化合成根皮素，最后通過糖基轉(zhuǎn)移酶作用在其上2′位上糖基化形成根皮苷，而糖基轉(zhuǎn)移酶是合成根皮苷的最后一步關(guān)鍵酶。目前關(guān)于查爾酮類和黃酮類物質(zhì)的體內(nèi)合成和代謝已經(jīng)在基因和酶的水平上做了大量的研究[16]，其合成和代謝機(jī)理已經(jīng)清楚，另外研究表明植物中含有多種糖基轉(zhuǎn)移酶，前期有學(xué)者對草莓、葡萄、玉米、茄子、金魚草、大豆等植物中的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了分子生物學(xué)特性研究[17-22]，由于糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物特異性，也有關(guān)于人參皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶、查爾酮糖基轉(zhuǎn)移酶、花青素糖基轉(zhuǎn)移酶、葛根素糖基轉(zhuǎn)移酶、甜葉菊苷糖基轉(zhuǎn)移酶等的研究[23-28]。但蘋果中二氫查爾酮類物質(zhì)的生物合成過程中關(guān)鍵酶（糖基轉(zhuǎn)移酶）編碼基因仍然不甚清晰，該酶在蘋果生長發(fā)育過程中的表達(dá)模式也未涉及。

本研究以蘋果為材料，在本課題組前期測序基礎(chǔ)上，篩選一條與查爾酮糖基轉(zhuǎn)移酶親緣關(guān)系最近的根皮苷-2-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（phloridzin 2′-O-glycosyltransferase，P2′-GT）的基因序列進(jìn)行研究。提取蘋果RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)克隆P2′-GT cDNA并測序獲得全長序列，進(jìn)行該基因的生物信息學(xué)分析，并將基因編碼產(chǎn)物與其他物種糖基轉(zhuǎn)移酶序列進(jìn)行同源性分析，再利用實(shí)時熒光定量PCR（real-time fl uorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）技術(shù)分析P2′-GT基因在蘋果不同部位和不同品種蘋果中的時空表達(dá)模式，為P2′-GT基因在調(diào)控根皮苷合成過程中的功能研究提供理論基礎(chǔ)，為培育高品質(zhì)蘋果品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果樣品采自陜西白水蘋果試驗(yàn)站，選擇富士（Fuji）、澳洲青蘋（Granny Smith）、嘎啦（Gala）為材料，2017年6—10月采集3 個品種成熟期的根、葉、果實(shí)，每個樣品采集3 個重復(fù)，采集土壤下10 cm處的樹根和沒有破損的樹葉，果實(shí)采集后用小刀取果皮切成小片，果肉切成小塊，所有樣品用錫箔紙包裝放入液氮速凍后快速置于-80 ℃冰箱中備用[29]。嘎啦品種從花后1 周采集生長初期樣品，生長5 周采集生長中期樣品，生長10 周采集成熟期樣品；富士和澳洲青蘋品種從花后1 周采集生長初期樣品，生長10 周采集生長中期樣品，生長20 周采集成熟期樣品。每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)。

pMD-19T載體、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、植物RNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimScript?帶基因組DNA清除酶反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、TaqDNA聚合酶、氨芐青霉素、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，DNTP） 大連TaKaRa生物有限公司。

LB培養(yǎng)基用于感受態(tài)大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

QuantStudio 3 RTFQ-PCR 美國Thermo Fisher公司；T100TMPCR儀、Powerpac通用電泳儀 美國Bio-Rad公司；RP1000910059可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；Tanon 4200凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺 蘇州凈化儀器有限公司；CMS-20A磁力攪拌器 鄭州長城儀器有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制作有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；JA2003電子天平 上海浦春計(jì)量儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果總RNA提取

采用生工生物工程（上海）股份有限公司的植物RNA快速抽提試劑盒（Plant Total RNA Isolation Kit）分別從3 個蘋果品種的皮、根、葉提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse Transcriptase reagent Kit with gDNA Eraser）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。P2′-GT基因的PCR合成引物參考文獻(xiàn)[30]，引物由武漢金凱瑞公司合成，擴(kuò)增P2′-GT基因引物序列如下：P2′-GT-F（5′-ATGGGAGACGTCATTGTACTG-3′）；P2′-GT-R（5′-TTATGTAATGCTACTAACAAAGTTG-3′）。

1.3.2P2′-GT基因cDNA克隆

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為PCR模板，對P2′-GT基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL（ExTaq2 μL，cDNA模板2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，Mg2+1.5 μL，上游引物P2′-GT-F 1 μL，下游引物P2′-GT-R 1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL）。P2′-GT基因的PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，53 ℃、40 s，72 ℃、90 s，循環(huán)35 次；72 ℃、10 min。擴(kuò)增結(jié)束后從PCR產(chǎn)物中吸取5 μL進(jìn)行核酸電泳檢測（1%瓊脂糖凝膠，電壓120 V，時間30 min，溴化乙錠染色時間15 min），然后通過凝膠成像系統(tǒng)檢測。將PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD-19T克隆載體上，轉(zhuǎn)入E. coliDH-5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆PCR鑒定，將正確的單菌落測序（測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成）。

1.3.3P2′-GT基因生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站利用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行同源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。P2′-GT基因生物信息學(xué)分析所用在線軟件如表1所示。

表1 相關(guān)在線軟件網(wǎng)址Table 1 Online software used in this study

1.3.4P2′-GT基因的時空表達(dá)模式分析

根據(jù)設(shè)計(jì)的PCR引物選取Actin為內(nèi)參基因[31]，以3 個蘋果品種的皮、葉、根和不同發(fā)育時期皮（初期、中期、成熟期）cDNA為模板，進(jìn)行RTFQ-PCR，采用SYBRRPremix EXTaqTMII試劑盒，在RTFQPCR儀上檢測基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系20 μL，其中SYBR?Premix EXTaqTMII 10 μL，上游引物P2′-GT-F 1 μL，下游引物P2′-GT-R 1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。P2′-GT基因的RTFQ-PCR擴(kuò)增條件：預(yù)熱溫度94 ℃、時間4 min；解鏈溫度94 ℃、時間15 s，退火溫度53 ℃、時間40 s，循環(huán)45 次。每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 18.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 P2′-GT基因全長cDNA克隆

圖1 P2′-GT cDNA PCR擴(kuò)增Fig. 1 Electropherogram of PCR-ampli fi ed P2′-GT cDNA

以蘋果組織cDNA為模板PCR擴(kuò)增P2′-GT基因，與克隆載體pMD-19T連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，后測序獲得一條1 452 bp的基因片段（圖1）。

2.2 P2′-GT序列分析

利用在線工具ProtParam分析P2′-GT氨基酸序列結(jié)果表明，P2′-GT編碼483 個氨基酸，理論分子質(zhì)量為53.6 kDa，等電點(diǎn)5.76，不穩(wěn)定指數(shù)42.6，根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)大于40即不穩(wěn)定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)[32]，該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。TMHMM分析結(jié)果見圖2a，P2′-GT基因編碼產(chǎn)物氨基酸跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)是11.73，前60 個氨基酸殘基數(shù)是10.53，跨膜蛋白判定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)顯示[33]，如果預(yù)測蛋白前60 個氨基酸中跨膜螺旋中有數(shù)個氨基酸殘基數(shù)，預(yù)測跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)大于18，則氨基酸很有可能存在跨膜序列，并且蛋白的N端可能存在信號肽，由此可以說明P2′-GT基因編碼產(chǎn)物不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，而且N端不存在信號肽。InterProScan分析結(jié)果（圖2b）顯示P2′-GT基因編碼產(chǎn)物有糖基轉(zhuǎn)移酶的家族特征結(jié)構(gòu)域，位于第359～402個氨基酸之間。SOPM分析結(jié)果（圖2c）顯示P2′-GT基因編碼產(chǎn)物存在α-螺旋、伸展鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。其有166 個氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的34.37%，100 個氨基酸形成伸展鏈，占所有氨基酸的20.7%，171 個氨基酸形成無規(guī)卷曲，占所有氨基酸的35.4%。Swiss-Model軟件進(jìn)行同源建模得到P2′-GT基因編碼產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)圖（圖2d），P2′-GT蛋白模型與對苯二酚葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶最高（41.32%）。

圖2 P2′-GT基因編碼產(chǎn)物生物信息學(xué)分析Fig. 2 Bioinformatic analysis of the protein encoded by P2′-GT gene

2.3 P2′-GT氨基酸序列同源性分析

圖3 P2′-GT基因編碼氨基酸與其他植物糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列比對Fig. 3 Alignment of amino acid sequence encoded by P2′-GT gene with those in other plants

將氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對分析，用DNAMAN將蘋果P2′-GT與其他物種的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行同源性比對，結(jié)果如圖3所示，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)P2′-GT與其他物種糖基轉(zhuǎn)移酶類似，在C末包含44 個氨基酸的糖基轉(zhuǎn)移酶保守序列（359～402），是一個酶超家族，該序列參與催化葡萄糖基連接到疏水基的過程，這表明P2′-GT是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的一種，推測其與其他植物的GT具有相同的功能。

用MEGA5.0軟件采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建蘋果P2′-GT的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明從蘋果中擴(kuò)增的P2′-GT基因的氨基酸序列與白梨（P. bretschneideriXP_009362434.1）中糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性最近，與木薯（M. esculentaOAY23754.1）糖基轉(zhuǎn)移酶、橡膠樹（H. brasiliensisXP_021650427.1）糖基轉(zhuǎn)移酶、蓖麻（R. communisXP_015576377.1）糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性最遠(yuǎn)，表明P2′-GT基因的氨基酸序列在同薔薇科中具有較高的保守性，親緣關(guān)系較近。

圖4 P2′-GT基因編碼產(chǎn)物系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of P2′-GT gene encoded product

2.4 P2′-GT基因表達(dá)模式

以富士、澳洲青蘋和嘎啦3 種蘋果的果肉、皮、根、葉的cDNA為模板，利用RTQF-PCR檢測P2′-GT基因在不同蘋果品種的不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示，P2′-GT基因在3 種蘋果的皮中均高效表達(dá)，在葉、根中微量表達(dá)，在果肉中不表達(dá)，說明P2′-GT基因在蘋果中為皮特異表達(dá)模式；P2′-GT基因在不同蘋果品種皮中表達(dá)量有顯著性差異（P＜0.05），澳洲青蘋皮中的表達(dá)量最高，在嘎啦皮中的表達(dá)量最低。以富士、澳洲青蘋和嘎啦3 種蘋果3 個不同發(fā)育時期皮cDNA為模板，利用RTQF-PCR檢測P2′-GT基因在不同蘋果品種的不同發(fā)育時期的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示，在3 個品種蘋果中，P2′-GT在果實(shí)發(fā)育初期皮中幾乎不表達(dá)，在果實(shí)發(fā)育中期表達(dá)量迅速增加到最高值，在果實(shí)成熟期表達(dá)量降至最高值的50%，表達(dá)量有顯著性差異（P＜0.05），與前期測定根皮苷在蘋果不同生長時期的含量變化呈正相關(guān)。

圖5 P2′-GT在不同品種不同組織的表達(dá)模式分析Fig. 5 Expression patterns of P2′-GT in different apple varieties and different organs

圖6 P2′-GT在不同品種不同發(fā)育時期的表達(dá)模式分析Fig. 6 Expression patterns of P2′-GT in different apple varieties and different growth periods

3 討論與結(jié)論

在蘋果根皮苷合成途徑中，P2′-GT是根皮苷合成途徑中的最后一個關(guān)鍵酶，在該酶的催化下根皮素在2′位上連接一分子的β-D-吡喃葡萄糖形成根皮苷，由于根皮苷具有多種生理功能且只存在于蘋果和多穗柯甜茶中，所以根皮苷的生物合成關(guān)鍵酶的基因克隆成為了研究熱點(diǎn)，這對于蘋果分子育種具有重要的意義。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上利用分子技術(shù)成功克隆出一條P2′-GT基因的cDNA全長序列，分析發(fā)現(xiàn)在P2′-GT氨基酸C端有糖基轉(zhuǎn)移酶的保守序列，位于第359～402個氨基酸，與其他植物糖基轉(zhuǎn)移酶有相同或相似的保守序列，推測其與其他植物的糖基轉(zhuǎn)移酶具有相同的功能。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)蘋果根皮苷P2′-GT與白梨親緣關(guān)系最近，同屬于薔薇科植物，說明P2′-GT具有較高的保守性。P2′-GT基因表達(dá)活性與根皮苷的累積呈正相關(guān)的關(guān)系，在蘋果發(fā)育初期P2′-GT表達(dá)量低，根皮苷含量相應(yīng)較低，在蘋果發(fā)育中期P2′-GT表達(dá)量達(dá)到最高，根皮苷含量也達(dá)到最高，在蘋果成熟期P2′-GT表達(dá)量有所下降，根皮苷含量也隨之下降；相比于根、葉、果肉，P2′-GT在蘋果皮中高效表達(dá)，根皮苷含量也是最高，在其他組織中微量表達(dá)或者不表達(dá)，根皮苷含量也隨之降低；此外，P2′-GT在不同蘋果品種中轉(zhuǎn)錄表達(dá)不同，在澳洲青蘋中高效表達(dá)，在嘎啦中微量表達(dá)，這與前期根皮苷含量測定結(jié)果相對應(yīng)[34]，在P2′-GT高效表達(dá)的時期、蘋果部位和蘋果品種時，根皮苷的含量也相應(yīng)增加，兩者之間呈正相關(guān)的關(guān)系。本研究通過對P2′-GT基因的氨基酸序列分析以及P2′-GT在不同蘋果品種、不同蘋果組織和不同蘋果生長時期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究P2′-GT在根皮苷合成過程中的功能及其分子育種方面提供了理論支持。