齊蕊名，于美玲，姜艷平，崔 文，張 希，王 麗，徐義剛，唐麗杰，李一經(jīng)，喬薪瑗*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳桿菌是公認(rèn)的食品級微生物[1]，是蔬菜、肉、魚和乳制品發(fā)酵食品中天然的微生物成分，也是人和動物胃腸道內(nèi)的益生菌。自2001年獲得植物乳桿菌WCFS1（Lactobacillus plantarum WCFS1）序列后，其成為乳酸菌研究的模式菌株之一[2]。植物乳桿菌代謝產(chǎn)生具有抑菌活性的細(xì)菌素[3]，還可形成生物被膜[4]，是一類安全的天然食品防腐劑。L. plantarumWCFS1與傳統(tǒng)發(fā)酵菌株協(xié)同發(fā)酵，在發(fā)酵乳中活性穩(wěn)定，可抑制后酸化和腐敗真菌[5-6]，提高食品的營養(yǎng)價值，增加其適口性[7-8]。蔬菜發(fā)酵時，植物乳桿菌可產(chǎn)生單寧，使其更適用于植物發(fā)酵[9]。植物乳桿菌還對金屬鉛和鎘具有吸附作用[10]。植物乳桿菌噬菌體可導(dǎo)致宿主菌的裂解，并引起菌體死亡，活菌數(shù)下降，導(dǎo)致發(fā)酵失敗，進(jìn)而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。

早在1983年，就已從肉制品發(fā)酵劑中分離到植物乳桿菌噬菌體[12]。Yoon等[13]首次從蔬菜發(fā)酵制品中分離得到L. plantarum噬菌體SC921。Lu Zhongjing等[14]從腌制黃瓜中分離得到1 株L. plantarum噬菌體φJ(rèn)L-1。Lanza等[15]第一次從橄欖發(fā)酵液中分離出植物乳桿菌噬菌體。研究結(jié)果證實(shí)，蔬菜發(fā)酵液中存在較為豐富的植物乳桿菌噬菌體[16]。此外，還有研究人員從玉米青貯和奶制品中分離出植物乳桿菌噬菌體[17-19]。有文獻(xiàn)曾對近60 a以來發(fā)現(xiàn)的231 個乳桿菌噬菌體進(jìn)行總結(jié)，根據(jù)形態(tài)特征，其中有109 株噬菌體屬于長尾病毒科，有76 株噬菌體屬于肌尾病毒科，僅有1 株噬菌體屬于短尾病毒科[20]。

乳桿菌在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用廣泛，但噬菌體對乳桿菌的感染卻可能導(dǎo)致發(fā)酵失敗，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且，目前對乳桿菌噬菌體的研究較少[20]。所以，本研究從發(fā)酵食品中分離植物乳桿菌噬菌體，研究其生物學(xué)特性、理化特性及吸附特性，為制定出有效的噬菌體防控策略提供理論依據(jù)。同時篩選抗乳桿菌噬菌體的抗性菌株，為進(jìn)一步應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

分離樣品為泡菜，購買于超市；L. plantarumWCFS1由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

DNaseI、RNaseA、綠豆核酸酶、T4 DNA連接酶美國NEB公司；e-Taq、限制性核酸內(nèi)切酶、Trans2K DNA Marker、Trans15K DNA Marker 寶生物工程（大連）有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；絲裂霉素C 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院；MRS肉湯培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物

ERIC1、ERIC2為乳桿菌基因組擴(kuò)增腸桿菌基因間重復(fù)一致性（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）序列的引物，用于進(jìn)行快速指紋圖譜分析[21]。引物M13、G1和1254為隨機(jī)排列的寡核苷酸序列，用于乳桿菌基因組隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction，RAPD-PCR），檢測DNA片段多態(tài)性[22]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of target DNA fragments

1.2 儀器與設(shè)備

H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Mastercycler nexus PCR儀 德國Eppendorf公司；MA120 DNA電泳儀 美國Bio-Rad公司；PB-10 pH計(jì) 德國Sartorius公司；Medifuge小型臺式離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；XL-1超速離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體的分離純化

參照張倩等[23]實(shí)驗(yàn)方法，通過雙層平板法分離噬菌體，并用連續(xù)單斑穿刺法進(jìn)行純化。不同之處為培養(yǎng)基使用添加10 mmol/L CaCl2和10 mmol/L MgSO4的MRS肉湯培養(yǎng)基（MCM），指示菌為L. plantarumWCFS1，32 ℃靜置培養(yǎng)24 h，半固體MCM培養(yǎng)基為0.4% MCM瓊脂培養(yǎng)基。噬菌體加15%的甘油，貯存于-80 ℃。

1.3.2 噬菌體感染宿主菌透射電鏡觀察

通過負(fù)染色法，透射電鏡觀察噬菌體Lpla感染L. plantarumWCFS1的吸附和釋放階段。具體步驟為：取100 μL過夜培養(yǎng)的L. plantarumWCFS1菌液與100 μL純化的噬菌體裂解液混勻，32 ℃溫育。在15 min和2 h時分別取少量滴于銅網(wǎng)上，10 min后用2%磷鎢酸染液（pH 7.0）染色10 s，然后將銅網(wǎng)放于干燥濾紙上，自然干燥后用Hitaclli7100型透射電鏡觀察。

1.3.3 噬菌體的形態(tài)觀察和結(jié)構(gòu)蛋白分析

參照文獻(xiàn)[24]中λ噬菌體顆粒提取方法濃縮噬菌體Lpla。負(fù)染色法透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，方法同1.3.2節(jié)。利用12%分離膠的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白的組成。

1.3.4 噬菌體包裝機(jī)制的分析

參照Quiberoni等[25]描述的方法，用酚氯仿法抽提噬菌體基因組，用DNaseI、RNaseA、綠豆核酸酶判定噬菌體基因組性質(zhì)。將一部分噬菌體DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII、XbaI和NheI進(jìn)行酶切，另一部分噬菌體DNA用T4連接酶進(jìn)行連接后再酶切，酶切產(chǎn)物均在70 ℃處理5 min后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.5 噬菌體生物學(xué)特性的測定

1.3.5.1 最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的測定

具體步驟參照張倩等[23]，首先測定對數(shù)生長期（OD600nm=0.5）的L. plantarum WCFS1菌濃度，再按MOI為0.001、0.01、0.1、1、10接入噬菌體Lpla，32 ℃培養(yǎng)過夜后測定Lpla滴度。

1.3.5.2 一步生長曲線的測定

將噬菌體Lpla以最佳MOI感染對數(shù)生長期的L. plantarum WCFS1，32 ℃溫育10 min，離心，棄上清液，再將沉淀重懸于預(yù)熱的MCM培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)于32 ℃，每15 min取適量混懸液并測定Lpla滴度。

1.3.5.3 噬菌體穩(wěn)定性的檢測

檢測不同溫度、pH值、乙醇、紫外線和糖類對噬菌體Lpla裂解的影響，參照文獻(xiàn)[22,25]所描述的方法。

1.3.5.4 噬菌體的吸附性質(zhì)

參照Quiberoni等[25]所描述的實(shí)驗(yàn)方法測定溫度、Ca2+和Mg2+和宿主菌生理狀態(tài)對Lpla吸附的影響。

1.3.6 抗噬菌體菌株的篩選

參照Guglielmotti等[26]的次級感染方法：將噬菌體Lpla以最佳MOI感染對數(shù)生長期的宿主菌，32 ℃培養(yǎng)48 h后涂板于MRS固體培養(yǎng)基上，待單菌落長出后連續(xù)純化3 代。將純化后的菌株和Lpla連續(xù)3 代共同培養(yǎng)于MCM液體培養(yǎng)基中，若所得菌株均能正常生長，且斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)均不形成透明空斑，則該菌株被確定為抗性菌株。

1.3.7 抗噬菌體菌株的鑒定

1.3.7.1 基因型鑒定

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取L. plantarum WCFS1及抗性菌株基因組。以基因組為模板，以ERIC-1、ERIC-2為引物，利用Ex Taq酶進(jìn)行ERIC-PCR；分別以M13、G1和1254為引物進(jìn)行RAPD-PCR[22]。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠核酸電泳。

1.3.7.2 表型鑒定

觀察L. plantarum WCFS1及抗性菌株的菌落形態(tài)。通過革蘭氏染色法觀察各菌株的形態(tài)；參照伯杰氏菌種鑒定手冊，利用微量生化反應(yīng)管測定抗性菌株的生化特性。

1.3.7.3 穩(wěn)定性測定

將抗性菌株與噬菌體Lpla共同連續(xù)培養(yǎng)40 代，每5 代用雙層平板法檢測噬菌體，測定噬菌斑效率（effieiency of plaquing，EOP）。EOP為以抗性菌為指示菌測得的噬菌體滴度/以敏感菌為指示菌測得的噬菌體滴度。

1.3.7.4 溶原性測定

將抗性菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，在OD600nm為0.1～0.2時添加絲裂霉素C（0.5 μg/mL），靜置培養(yǎng)8 h后10 000×g離心5 min，取上清液，再用雙層平板法檢測是否存在噬菌體。

1.3.7.5 發(fā)酵性能測定

將敏感菌株和抗性菌株分別按2%的接種量接種于12%脫脂乳中，42 ℃培養(yǎng)24 h。每2 h取樣，通過平板計(jì)數(shù)法測定菌株的生長曲線[27]。用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.4，測定酸化活性，表示為乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[28]。敏感菌株和抗性菌株均分為兩組，一組添加1×108個噬菌體Lpla，另一組不添加噬菌體。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較組間差異性。P＜0.05，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01，差異極顯著。使用Photoshop軟件進(jìn)行添加標(biāo)尺等圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

從泡菜中分離到L. plantarum噬菌體，命名為Lpla。噬菌斑呈透明圓形、邊緣清晰，直徑為1.08 mm，為烈性噬菌體的噬斑特征（圖1）。

圖1 Lpla噬菌斑Fig. 1 Plaques of phage Lpla

2.2 噬菌體感染宿主菌形態(tài)觀察

Lpla與L. plantarum混合15 min時，菌體表面聚集了一定數(shù)量的噬菌體（圖2B、C）。混合培養(yǎng)2 h時，細(xì)菌細(xì)胞壁溶解，邊緣模糊（圖2D）。表明Lpla可吸附并裂解L. plantarum WCFS1。

圖2 Lpla侵染L. plantarum透射電鏡圖Fig. 2 Transmission electron micrograph of L. plantarum infection with Lpla

2.3 噬菌體顆粒的形態(tài)觀察和結(jié)構(gòu)蛋白分析

通過透射電鏡觀察，噬菌體Lpla具有多面體頭部，直徑約為72 nm；具有非收縮性可彎曲的尾部，長約126 nm；尾部有尾鞘和復(fù)雜的基板（圖3A），根據(jù)形態(tài)將其歸為有尾噬菌體目，長尾噬菌體科，B1類。SDSPAGE分析Lpla有5 個主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中一個分子質(zhì)量約為45 kDa，其余條帶較弱，分子質(zhì)量分別約為 70、35、20 kDa和15 kDa（圖3B）。

圖3 Lpla透射電鏡形態(tài)（A）及結(jié)構(gòu)蛋白SDS-PAGE圖譜（B）Fig. 3 Transmission electron micrograph of Lpla (A) and SDS-PAGE analysis of Lpla structure proteins (B)

2.4 噬菌體包裝機(jī)制分析

噬菌體Lpla基因組可被DNaseI酶解、不被RNaseA和綠豆核酸酶酶解，說明Lpla基因組為雙鏈DNA。Lpla基因組經(jīng)HindIII、XbaI和NheI酶切，泳道3、5、7分別與4、6、8相比，酶解產(chǎn)物的條帶數(shù)沒有變化，說明噬菌體Lpla為pac-型包裝方式（圖4）。

圖4 噬菌體Lpla基因組酶切電泳圖譜Fig. 4 Electropherogram of Lpla genome digestion with restriction endonucleases

2.5 噬菌體的生物學(xué)特性

2.5.1 噬菌體最佳MOI

當(dāng)M O I為0.1時噬菌體L p l a滴度最高，可達(dá)（7.2±0.2）×108PFU/mL，與其他組相比差異極顯著（P＜0.01）（表2）。

表2 最佳MOI的測定Table 2 Optimal multiplicity of infection of phage Lpla

2.5.2 噬菌體一步生長曲線

由一步生長曲線可知噬菌體Lpla潛伏期為15 min，裂解期為180 min，裂解量為43 PFU/cell（圖5）。

圖5 噬菌體Lpla的一步生長曲線Fig. 5 One-step growth curve of Lpla

2.5.3 噬菌體的穩(wěn)定性

將噬菌體Lpla經(jīng)10%乙醇溶液處理20 min后，可致46%失活；處理40 min后，70%失活。經(jīng)25%乙醇溶液處理10 min后，76%失活，處理40 min后，幾乎全部失活。35%、50%和75%乙醇溶液分別處理噬菌體10 min即可全部失活（圖6A）。Lpla在37 ℃處理后，不影響其活性；45 ℃處理10 min后，93%失活；在56 ℃處理2 min即可全部失活（圖6B）。Lpla經(jīng)紫外線照射10 min后，79%失活；紫外線照射20 min后，98%失活（圖6C）。當(dāng)pH值為2時，噬菌體Lpla滴度下降5 個數(shù)量級；當(dāng)pH值為3時，噬菌體Lpla滴度下降1 個數(shù)量級；當(dāng)pH值為4～12時，Lpla滴度基本不變（圖6D）。葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、核糖、阿拉伯糖和果糖對Lpla均有較好的吸附作用（P＜0.01）（表3）。

圖6 噬菌體Lpla的穩(wěn)定性Fig. 6 Evaluation of phage Lpla stability

表3 不同糖類對噬菌體的吸附作用Table 3 Adsorption of phage Lpla by different saccharides

2.5.4 不同理化因素對噬菌體吸附性質(zhì)的影響

在4 ℃時，Lpla對宿主菌的吸附率最高，可達(dá)98.3%。25 ℃時，吸附率為44%，32 ℃時，吸附率為36.17%（圖7A）。Lpla在MRS-Ca、MRS-Mg和MCM培養(yǎng)液中的吸附率均大于在MRS液體培養(yǎng)基中的吸附率，且MRS-Ca培養(yǎng)基效果最好（圖7B）。同正常細(xì)胞相比，噬菌體Lpla對滅活宿主細(xì)胞的吸附率下降了20%（圖7C）。

圖7 物理?xiàng)l件及化學(xué)試劑對噬菌體吸附性質(zhì)的影響Fig. 7 Effects of physical and chemical agents on phage Lpla adsorption

2.6 抗噬菌體菌株的篩選鑒定結(jié)果

采用次級感染法篩選L. plantarumWCFS1自發(fā)突變抗噬菌體菌株。挑取20 個單菌落，通過鑒定后，確定6 株為抗噬菌體菌株，分別命名為L. plantarumWCFS1（01～06）。

2.6.1 基因型分析

抗性菌與敏感菌L. plantarumWCFS1 ERIC-PCR圖譜一致（圖8A），說明抗性菌為敏感菌自發(fā)突變。引物M13、G1和1254擴(kuò)增的抗性菌與敏感菌L. plantarumWCFS1 RAPD-PCR圖譜一致（圖8B），說明抗性菌與敏感菌具有遺傳同源性，不是污染菌株。

表4 敏感菌與抗性菌的生化反應(yīng)結(jié)果Table 4 Biochemical reactions of sensitive strains and phage-resistant mutants

圖8 敏感菌和抗性菌的DNA指紋圖譜Fig. 8 DNA fi ngerprints of sensitive strains and phage-resistant mutants

2.6.2 抗噬菌體菌株表型特征

圖9 敏感菌與抗性菌的形態(tài)特性Fig. 9 Morphology of sensitive strains and phage-resistant mutants

敏感菌L. plantarumWCFS1及抗噬菌體菌株的菌落均為乳白色、圓形、邊緣不整齊和中間凸起的菌落（圖9A、B）。經(jīng)革蘭氏染色，敏感菌和抗噬菌體菌株均為革蘭氏陽性桿菌（圖9C、D）?？故删w菌株與L. plantarumWCFS1的菌落和菌體形態(tài)無明顯區(qū)別，且抗噬菌體菌株與L. plantarumWCFS1生化反應(yīng)結(jié)果一致（表4）。

2.6.3 抗噬菌體菌株的遺傳穩(wěn)定性

將L. plantarumWCFS1及抗噬菌體菌株共同連續(xù)培養(yǎng)40 代，均無噬菌體裂解現(xiàn)象。第40代，斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)Lpla可裂解L. plantarumWCFS1，形成空斑，卻不裂解抗性菌株（圖10）。說明抗性菌株具有遺傳穩(wěn)定性，且EOP小于10-5。

圖10 L. plantarum WCFS1（A）與抗性菌L. plantarum WCFS1 01（B）斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 10 Plaque test of sensitive strains (A) and phage-resistant mutants (B)

2.6.4 抗噬菌體菌株溶原性測定結(jié)果

經(jīng)絲裂霉素C誘導(dǎo)的抗性菌株菌液上清中均未檢測到噬菌體顆粒，不存在釋放噬菌體的安全隱患。

2.6.5 抗噬菌體菌株發(fā)酵性能測定結(jié)果

圖11 敏感菌和抗性菌的生長曲線（A）和酸化活性（B）Fig. 11 Growth curves (A) and acidification activity (B) of sensitive strains and phage-resistant mutants

敏感菌與抗性菌在12%脫脂乳中培養(yǎng)，生長狀態(tài)良好。敏感菌添加噬菌體Lpla培養(yǎng)時，活菌數(shù)明顯下降，而抗性菌與噬菌體Lpla培養(yǎng)時，活菌數(shù)變化不明顯（圖11A），說明抗性菌在發(fā)酵時的生長特性與敏感菌一致。不添加噬菌體時，抗性菌與敏感菌的產(chǎn)酸量沒有明顯差異，說明抗性菌的產(chǎn)酸能力與敏感菌一致。添加噬菌體后，敏感菌的產(chǎn)酸量明顯下降，抗性菌產(chǎn)酸量無明顯變化（圖11B）。

3 討 論

近年來，乳酸菌噬菌體的相關(guān)研究發(fā)展迅速，但我國目前關(guān)于植物乳桿菌噬菌體的報(bào)道仍然較少。國外學(xué)者曾從肉制品發(fā)酵劑、青貯飼料、奶制品和腌制黃瓜中分離出植物乳桿菌噬菌體[26]，但目前只獲得6 株植物乳桿菌噬菌體的全基因組序列。

本研究分離得到的L. plantarum WCFS1噬菌體Lpla為烈性噬菌體，分析理化因素對Lpla裂解及吸附的影響，可為制定防治噬菌體感染的有效策略提供理論依據(jù)。噬菌體Lpla對熱較為敏感，56 ℃處理2 min即可全部失活，但植物乳桿菌噬菌體P1在50 ℃處理30 min仍生長良好[19]，噬菌體fri在70 ℃處理5 min才失活[29]，說明Lpla的熱穩(wěn)定性比其他植物乳桿菌噬菌體弱。而與其他可耐受50%乙醇的乳桿菌噬菌體phiLdb[30]和Lcb[31]相比，Lpla對乙醇較為敏感，同時，Lpla對紫外線亦不耐受。而且，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、核糖、阿拉伯糖和果糖均可吸附噬菌體。所以，生產(chǎn)過程中可通過添加上述糖類吸附噬菌體，從而抑制其對宿主菌的吸附。利用高溫、紫外線和乙醇可以滅活生產(chǎn)環(huán)境中的噬菌體。本研究證實(shí)Lpla在25 ℃和32 ℃時吸附率下降，而植物乳桿菌最適生長溫度為30～35 ℃，因此，在發(fā)酵過程中，可通過降低溫度減少噬菌體吸附[32]。同時也可在生產(chǎn)中通過使用不添加Ca2+和Mg2+的生產(chǎn)介質(zhì)，來降低Lpla的吸附率。

目前，在生產(chǎn)實(shí)踐中，已通過優(yōu)化生產(chǎn)環(huán)境和使用噬菌體抑制劑等多種措施來預(yù)防噬菌體的污染。但噬菌體污染現(xiàn)象在工業(yè)生產(chǎn)中仍普遍存在。因此，抗噬菌體菌株的篩選和構(gòu)建具有重要的實(shí)踐意義[22]。而次級感染法是一種可獲得自發(fā)突變抗噬菌體菌株的方法，操作簡便，不涉及遺傳操作[26]。故本研究采用此方法篩選對噬菌體Lpla具有抗性的植物乳桿菌，抗性菌株與敏感菌株形態(tài)、生化特性及發(fā)酵性能無差別，基因型分析表明抗性菌株源于敏感菌，且抗性具有遺傳穩(wěn)定性，為其進(jìn)一步應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供支持。