馬國(guó)涵，馬歡歡，呂欣然，劉佳伊，孫 悅，白鳳翎,*，勵(lì)建榮

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

水產(chǎn)類富含豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)，引起其腐敗變質(zhì)的微生物主要為細(xì)菌[1-3]。Sharma等[4]從腐爛魚鰭和尾巴分離獲得導(dǎo)致魚體外寄生潰瘍綜合征的6 種病原菌，分別為Enterococcus faecalis、Aeromonas hydrophilla、Cellobiosococcus sciuri和Micrococcus luteus。

目前生物保鮮技術(shù)已成為控制生鮮食品腐敗變質(zhì)的主要方法之一[5-6]。而乳酸菌nisin及一些植物提取物抑菌譜較窄，因此，從自然生態(tài)環(huán)境中尋找具有廣譜拮抗活性的乳酸菌對(duì)控制水產(chǎn)品腐敗菌具有重要的研究?jī)r(jià)值。Rauta等[7]從攀鱸魚腸道分離獲有較強(qiáng)抑菌作用的乳酸菌Lactobacillus casei，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)Proteus vulgaris和Klebsiella pneumoniae均具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌直徑可達(dá)15～18 mm。Ghomrassi等[8]從地中海海岸地區(qū)捕捉的烏頰魚鯉科魚、叉牙鯛和海鯛等8 種海魚皮膚表面和腸道獲得18 株乳酸菌，經(jīng)16S rRNA鑒定有15 株E. faecalis和3 株L. lactis，其中E. faecium HTE5抑菌譜較廣，可有效抑制Listeria monocytogenes等魚類病原菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析，細(xì)菌素類為其抑菌的有效成分。Gerez等[9]應(yīng)用96 孔板法從不同源的91 株乳酸菌中獲得1 株產(chǎn)抗菌肽的菌株Lactobacillus fermentum CRL251，其無(wú)細(xì)胞上清液（cell-free supernatant，CFS）對(duì)Aspergillus niger CH101和Fusarium graminearum CH103的抑菌率均大于80%，抗菌肽分子質(zhì)量小于10 ku。Ullah等[10]從傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離1 株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均具有良好抑菌作用的L. casei，經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析、HiPrep QXL 16/10柱的AKTA蛋白純化系統(tǒng)和反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）純化，后經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間（matrix-assisted laser desorption ionisation/time-offl ight/time-of- fl ight，MALDI-TOF/TOF）質(zhì)譜分析測(cè)定其細(xì)菌素分子質(zhì)量為4.89 ku。乳酸菌在自然界分布廣泛，海洋魚類腸道是乳酸菌的重要棲息地。本研究從養(yǎng)殖大菱鲆腸道中分離篩選廣譜抑菌活性物質(zhì)的乳酸菌，并對(duì)其抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離、提純及鑒定，為一種控制水產(chǎn)品腐敗的新型高效食品級(jí)生物防腐劑的研發(fā)和應(yīng)用奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大菱鲆購(gòu)自遼寧省錦州市金凌商場(chǎng)。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）CMCC 63301 中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；地衣芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ACCC 11091 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）ATCC 19115、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 9027、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）ATCC BB-170 美國(guó)典型菌種保藏中心；熒光假單胞菌（Pseudomonas fl uorescens）P001、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）L002分離自大菱鲆體表。

LB肉湯、MRS培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乳酸菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶 華藍(lán)化學(xué)有限公司；α-氰基-4-羥肉桂酸（α-cyano-4-hydoxycinnamic acid，HCCA） 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；DNA Marker-D、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master mix生工生物工程（上海）股份有限公司；乙酸乙酯、石油醚 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；Sephadex G-25美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；賽福智能生化培養(yǎng)箱寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；5804R冷凍高速離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；PCR儀 德國(guó)艾本德股份有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；LabconcoFreeZone 2.5臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；Labscale TFF System小型切向流超濾系統(tǒng) 上海密理博貿(mào)易有限公司；1260 HPLC儀 美國(guó)Agilent公司；MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 大菱鲆腸道中乳酸菌的分離

稱取大菱鲆的腸道10.0 g，切成約2.0 cm長(zhǎng)的片段，轉(zhuǎn)移至裝有90 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，經(jīng)充分振蕩后靜置10 min。吸取100 μL液體涂布于加入1% CaCO3的MRS瓊脂平板，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取白色且有明顯溶鈣圈的菌落進(jìn)行純化。純化培養(yǎng)后，選取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩。

1.3.2 廣譜性抑菌作用乳酸菌的篩選

1.3.2.1 乳酸菌CFS的制備

取10 mL初篩菌株培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液，經(jīng)4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾獲得CFS，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 指示菌的制備

將保藏于-80 ℃的銅綠假單胞菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、溫和氣單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌和哈維氏弧菌分別接種LB液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)12 h，經(jīng)2 代活化后，用滅菌生理鹽水制備成106CFU/mL的指示菌菌懸液。

1.3.2.3 廣譜性菌株的篩選

以菌株LP1-作為目標(biāo)菌，銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、溫和氣單胞菌和哈維氏弧菌4 株革蘭氏陰性菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌4 株革蘭氏陽(yáng)性菌為指示菌，參照文獻(xiàn)[11]應(yīng)用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法對(duì)菌株LP1-4 CFS進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 乳酸菌菌株鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（8版）中乳酸菌的鑒定方法進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)[12-14]。

1.3.3.2 16S rRNA鑒定

在1.5 m L E P管中加入1.0 m L乳酸菌培養(yǎng)12 h發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min收集菌體，使用16S rRNA通用引物對(duì)DNA快速抽提試劑盒提取的菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物為1492r（5′-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3′），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、DNA模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL、Taq PCR Master mix 12.5 μL，總體積25 μL。PCR擴(kuò)增步驟：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，72 ℃保持10 min，循環(huán)30 次，4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠成像系統(tǒng)的擴(kuò)增效果并照相。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)校對(duì)后與NCBI上GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.4 乳酸菌生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

在10 mL MRS液體培養(yǎng)基中接種200 μL乳酸菌發(fā)酵液，37 ℃靜置培養(yǎng)。利用來(lái)源和應(yīng)用的相似相容原則，以分離自大菱鲆的熒光假單胞菌和溫和氣單胞菌為指示菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[11]每隔4 h測(cè)定菌株CFS的抑菌活性，并測(cè)定菌懸液pH值和OD600nm值。

1.3.5 影響乳酸菌CFS拮抗活性因素分析

酶敏感性實(shí)驗(yàn)：將乳酸菌CFS分別用1.0 mol/L NaOH溶液和1.0 mol/L HCl溶液調(diào)至酶的最佳pH值（中性蛋白酶pH 7.0、木瓜蛋白酶pH 7.0、胰蛋白酶pH 7.5、胃蛋白酶pH 2.0和堿性蛋白酶pH 10.0），在乳酸菌CFS中添加終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的蛋白酶，37 ℃水浴中孵育2 h后，將pH值調(diào)至初始值，同時(shí)以乳酸菌CFS作對(duì)照，參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

pH值實(shí)驗(yàn)：用1.0 mol/L HCl溶液和1.0 mol/L NaOH溶液將乳酸菌CFS pH值分別調(diào)至2.5、3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以所對(duì)應(yīng)的相同pH值MRS作空白對(duì)照。

熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：分別經(jīng)50、100、121 ℃對(duì)乳酸菌CFS處理30 min，參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以乳酸菌CFS作對(duì)照。

1.3.6 細(xì)菌素初級(jí)純化

1.3.6.1 有機(jī)溶劑萃取

利用乙酸乙酯和石油醚分別對(duì)菌株LP1-4 CFS進(jìn)行萃取。取菌株LP1-4 CFS 100 mL置于500 mL分液漏斗中，然后取有機(jī)溶劑100 mL，分5 次加入分液漏斗中，并沿同一方向緩慢振蕩，靜置5 min左右至液體出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，收集下層溶液于滅菌錐形瓶，上層乳化液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶。將萃取5 次獲得乳化液統(tǒng)一收集，真空條件下100 r/min、45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至液體顏色澄清收集萃取液，水相作為陰性對(duì)照，乳酸菌CFS為陽(yáng)性對(duì)照，按

1.3.2.3 節(jié)方法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.3.6.2 乳酸菌抗菌活性物質(zhì)的分離純化

參照邢德明等[15]方法并稍作修改。取上述乙酸乙酯萃取后獲得乳酸菌粗提物經(jīng)LabscaleTMTFF System分級(jí)純化，按分子質(zhì)量（m）大小分成的4 個(gè)組分樣品：組I（10 ku＜m＜30 ku）、組II（5 ku＜m＜10 ku）、組III（1 ku＜m＜5 ku）、組IV（m＜1 ku），菌株LP1-4粗提物為對(duì)照組，參照1.3.2.3節(jié)方法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 細(xì)菌素的層析

參照Muhialdin等[16]方法并稍作修改，利用Sephadex G-25凝膠層析對(duì)超濾液體進(jìn)一步純化。稱取5.0 g干燥Sephadex G-25 medium粉末于50 mL蒸餾水中浸泡過(guò)夜，沸水煮沸30 min，抽真空排氣2 h。用0.02 mol/L pH 6.0磷酸緩沖鹽溶液裝柱平衡過(guò)夜，控制流速為0.5 mL/min。上樣量2.0 mL，收集洗脫液按1.3.2.3節(jié)方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。并將具有抑菌活性的洗脫液于250 mL滅菌燒杯中-40 ℃真空冷凍干燥4 d，取出后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 HPLC純化

參照An Junying等[17]方法并稍作修改。取上述凍干物加入1 mL滅菌超純水，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相：A為0.1%三氟乙酸水溶液，B為0.1%三氟乙酸甲醇溶液；洗脫條件：流動(dòng)相B，0%～0%平衡4 min，0%～100%梯度洗脫21 min，100%～100%平衡6 min，100%～0%梯度洗脫3 min，0%～0%平衡6 min；色譜柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣100 μL。收集單峰洗脫液，參照1.3.2.3節(jié)方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并收集具有抑菌活性洗脫液于10 mL滅菌離心管，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9 質(zhì)譜分析

經(jīng)HPLC純化后的液體取1.0 μL點(diǎn)在樣品靶上，待干燥后，同樣點(diǎn)1.0 μL的HCCA基質(zhì)溶液，全部干燥后上機(jī)分析。樣品靶放入MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀，啟動(dòng)控制軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。質(zhì)譜采集參數(shù)：正離子反射模式，一級(jí)質(zhì)譜分子質(zhì)量范圍為0.7～3.5 ku，二級(jí)質(zhì)譜分子質(zhì)量范圍為0.04～1.05 ku。搜庫(kù)鑒定：1）合并一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，產(chǎn)生 peaklist文件；2）利用 MASCOT搜索引擎進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索。檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)，搜庫(kù)參數(shù)：酶：Rrypsin；最大允許錯(cuò)切位點(diǎn)1；固定修飾：脲甲基；可變修飾：氧化；一級(jí)質(zhì)譜容差：1.5×10-4；二級(jí)質(zhì)譜容差：0.6 Da；P≤0.05。

1.4 數(shù)據(jù)處理

均重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，數(shù)據(jù)采用 ±s形式，應(yīng)用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖，并采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)廣譜性抑菌活性物質(zhì)乳酸菌的篩選

從大菱鲆腸道中篩選出15 株革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性且具有明顯溶鈣圈的乳酸菌，按分離順序和中文首字母進(jìn)行命名。進(jìn)一步應(yīng)用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法篩選出5 株對(duì)指示菌具有較強(qiáng)抑制作用的乳酸菌，分別為L(zhǎng)P1-6、LP1-4、LP4-3、LP2-3和LP3-2。從表1可以看出，5 株乳酸菌CFS對(duì)8 株指示菌均存在不同程度的抑制作用。菌株LP1-4對(duì)8 株指示菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌譜較廣，菌株LP1-6和LP2-3次之，菌株LP4-3和LP3-2僅對(duì)特定指示菌具有良好的抑制作用。結(jié)果表明，菌株LP1-4生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了具有廣譜性抑菌活性物質(zhì)。因此，選取菌株LP1-4作為下一步的實(shí)驗(yàn)菌株。

表1 乳酸菌對(duì)8 株指示菌的抑菌結(jié)果Table 1 Antibacterial results of lactic acid bacteria against eight indicator bacteria

2.2 乳酸菌菌株鑒定

2.2.1 生理生化反應(yīng)

依照文獻(xiàn)[14]對(duì)菌株LP1-4的生理生化鑒定結(jié)果（表2）進(jìn)行分析，可初步判定菌株LP1-4為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

表2 菌株LP1-4的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identi fi cation results of strain LP1-4

2.2.2 16S rRNA鑒定

應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)菌株LP1-4 PCR產(chǎn)物的分離結(jié)果見圖1，Marker內(nèi)含子分子質(zhì)量為100、250、500、750、1 000 bp和2 000 bp，菌株LP1-4在1 500 bp左右出現(xiàn)熒光條帶。對(duì)菌株LP1-4 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)其16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 448 bp。

圖1 菌株LP1-4的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Electropherogram of PCR-amplified 16S rRNA gene of LP1-4

圖2是將菌株LP1-4的測(cè)序結(jié)果使用MEGA 5.0軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果，菌株LP1-4與1株標(biāo)準(zhǔn)菌株L. plantarumSMN1-5的同源性達(dá)到99%，可確定菌株LP1-4為L(zhǎng). plantarum。

圖2 菌株LP1-4的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of LP1-4

2.3 乳酸菌生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

乳酸菌代謝過(guò)程中可產(chǎn)生細(xì)菌素、羅伊菌素、乳酸等拮抗性產(chǎn)物，可有效抑制細(xì)菌、霉菌等生長(zhǎng)繁殖[15]。以溫和氣單胞菌和熒光假單胞菌為例，由圖3可看出，菌株LP1-4的細(xì)胞生長(zhǎng)量和抑菌活性之間呈同步增長(zhǎng)。乳酸菌生長(zhǎng)16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)抑菌活性仍處于上升的趨勢(shì)；培養(yǎng)24 h時(shí)菌株LP1-4抑菌直徑達(dá)到峰值，對(duì)溫和氣單胞菌和熒光假單胞菌抑菌直徑分別為20.87 mm和19.96 mm；后隨著培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)延長(zhǎng)，抑菌活性與24 h相比差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇培養(yǎng)24 h的CFS作為抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳時(shí)間。

圖3 菌株LP1-4的生長(zhǎng)及拮抗活性曲線Fig. 3 Growth and antagonistic activity curves of LP1-4

2.4 影響乳酸菌CFS拮抗性的因素

2.4.1 酶敏感性實(shí)驗(yàn)

蛋白酶敏感性測(cè)定可確定抑菌活性物質(zhì)是否具有蛋白特性[18]。從圖4可看出，經(jīng)不同蛋白酶處理后菌株LP1-4 CFS抑菌活性呈不同程度的喪失，與對(duì)照組相比差異性顯著（P＜0.05）。而經(jīng)堿性蛋白酶處理后菌株LP1-4 CFS對(duì)溫和氣單胞菌和熒光假單胞菌的抑菌活性分別降低了40.33%和32.04%，呈極顯著性差異（P＜0.01），表明抑菌活性物質(zhì)對(duì)堿性蛋白酶極敏感。初步判斷株菌LP1-4 CFS抑菌活性物質(zhì)可能還具有蛋白特性的細(xì)菌素類。任士菊等[19]發(fā)現(xiàn)冷水魚腸道源乳酸菌抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶比較敏感，并證實(shí)類細(xì)菌素或細(xì)菌素存在于抑菌組分中。

圖4 酶處理對(duì)菌株CFS抑菌活性的影響Fig. 4 Effects of enzyme treatment on the antibacterial activity of CFS

2.4.2 pH值實(shí)驗(yàn)

從表3可看出，菌株LP1-4 CFS抑菌直徑隨著pH值升高呈下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 4.5時(shí)，菌株LP1-4 CFS對(duì)溫和氣單胞菌和熒光假單胞菌的抑菌直徑均呈顯著性降低（P＜0.05），分別為16.23 mm和15.43 mm，而MRS組抑菌活性完全喪失。pH 5.0時(shí)，CFS仍具有較弱的抑菌活性；當(dāng)pH值升到5.5后CFS抗菌活性完全喪失（pH 5.5～6.5，表中均未給出）。結(jié)果表明，菌株LP1-4 CFS的抑菌活物質(zhì)在酸性條件下比較穩(wěn)定，且抑菌活性物質(zhì)pH值適應(yīng)范圍2.5～5.0。

表3 pH值對(duì)菌株LP1-4 CFS抑菌活性的影響Table 3 Effects of pH on the antibacterial activity of LP1-4 CFS

2.4.3 熱處理實(shí)驗(yàn)

從圖5可看出，不同溫度處理后菌株LP1-4 CFS的抑菌直徑變化差異性不顯著（P＞0.05），且121 ℃處理后的CFS仍均有較強(qiáng)的抗菌作用。結(jié)果表明，菌株LP1-4 CFS中抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。相似研究已有報(bào)道，劉國(guó)榮等[20]從母乳嬰兒糞便中獲得產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌Lactobacillus rhamnosus，121 ℃處理后細(xì)菌素活性仍然保持穩(wěn)定。

圖5 熱處理對(duì)菌株LP1-4 CFS抑菌活性的影響Fig. 5 Effects of thermal treatment on the antibacterial activity of LP1-4 CFS

2.5 細(xì)菌素初級(jí)純化

小分子多肽或蛋白類的細(xì)菌素通常采用有機(jī)溶劑萃取法[21]。從表4可看出，菌株LP1-4 CFS經(jīng)乙酸乙酯萃取后，萃取液的有機(jī)相抑菌直徑與CFS相比差異顯著（P＜0.05），抑菌直徑為25.42 mm，水相抑菌效果較小。經(jīng)石油醚萃取后，萃取液的有機(jī)相和水相與CFS相比對(duì)溫和氣單胞菌抑菌直徑不具有顯著性差異（P＞0.05）。分析表明，與石油醚相比應(yīng)用乙酸乙酯作為萃取劑可較大程度上提取菌株LP1-4 CFS中的細(xì)菌素。因此，選擇乙酸乙酯作為萃取劑進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表4 菌株LP1-4 CFS的粗提取結(jié)果Table 4 Diameters of inhibition zone of A. sobria when exposed to different solvent extracts of LP1-4 CFS mm

菌株LP1-4萃取液采用Labscale TFF System小型切向流超濾系統(tǒng)分級(jí)純化后，發(fā)現(xiàn)組I、II、III和IV的收集液對(duì)溫和氣單胞菌抑菌直徑與對(duì)照組相比不具有顯著性（P＞0.05，數(shù)據(jù)均未給出）。表明菌株LP1-4 CFS中細(xì)菌素分子質(zhì)量可能小于1.0 ku。

2.6 細(xì)菌素中度純化

根據(jù)分子大小凝膠層析能對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行有效分離[22-23]。圖6是菌株LP1-4細(xì)菌素經(jīng)G-25凝膠層析，不同時(shí)間點(diǎn)洗脫液對(duì)溫和氣單胞菌的抑菌結(jié)果，120 min的洗脫液對(duì)溫和氣單胞菌具有抑制作用，抑菌直徑為15.88 mm，低于對(duì)照組，原因是由于抑菌物質(zhì)回收后被稀釋。結(jié)果表明，菌株LP1-4 CFS中抑菌活性物質(zhì)存在于120 min收集管洗脫液，收集并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖6 菌株LP1-4 CFS經(jīng)G-25交聯(lián)葡聚糖柱層析后拮抗作用效果（中間孔中為洗脫液）Fig. 6 Antagonistic effects of substances separated by SephadexG-25 column chromatography from LP1-4 CFS

2.7 HPLC純化

HPLC是純化細(xì)菌素有效方法之一[24-25]，從圖7可看出，經(jīng)Agilent TC-C18色譜柱檢測(cè)分別得到3、5、11 min三個(gè)峰。對(duì)其洗脫液進(jìn)行抑菌作用研究，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間5 min峰洗脫液對(duì)溫和氣單胞菌的抑菌直徑為15.86 mm，其余2 峰洗脫液均無(wú)抑菌作用。結(jié)果表明，抑菌物質(zhì)在液相分離條件下的目標(biāo)峰保留時(shí)間為5 min。

圖7 菌株LP1-4細(xì)菌素的HPLC圖Fig. 7 HPLC profile of bacteriocin produced by LP1-4

2.8 質(zhì)譜分析

應(yīng)用質(zhì)譜法分析菌株LP1-4細(xì)菌素分子質(zhì)量及氨基酸排列順序[26-28]，從圖8可看出，該細(xì)菌素分子質(zhì)量為0.854 ku，與分級(jí)純化結(jié)果相輔相成。Casaburi等[29]分離自傳統(tǒng)意大利發(fā)酵香腸中Lactobacillus curvatus54M16對(duì)L. monocytogenes、Bacillus cereus和Brochotrix thermosphacta當(dāng)具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌活性物質(zhì)經(jīng)反相HPLC純化后經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)其分子為2.5 ku。經(jīng)搜庫(kù)鑒定分析得出，菌株LP1-4細(xì)菌素由5 種氨基酸組成的8 個(gè)氨基酸序列，肽鏈中氨基酸的排列順序?yàn)椤肮劝彼?天冬酰胺-賴氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-賴氨酸（ENKPAAPK）”。經(jīng)NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)菌株LP1-4細(xì)菌素氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中肽鏈相似最高分值僅為27.8，表明菌株LP1-4細(xì)菌素肽鏈屬于新型肽段[30]。

圖8 菌株LP1-4細(xì)菌素質(zhì)譜圖Fig. 8 Mass spectrum of bacteriocin produced by strain LP1-4

3 結(jié) 論

本研究廣譜拮抗活性乳酸菌菌株分離、篩選自大菱鲆腸道中，經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rRNA鑒定菌株LP1-4為植物乳桿菌（L. plantarum）。菌株LP1-4抑菌活性物對(duì)蛋白類敏感，對(duì)酸性環(huán)境具有一定耐受性，且具有良好的熱穩(wěn)定性。經(jīng)分離純化和質(zhì)譜分析表明其細(xì)菌素分子質(zhì)量為0.854 ku，由5 種氨基酸組成的8 個(gè)氨基酸序列，肽鏈中氨基酸的排列順序?yàn)椤肮劝彼?天冬酰胺-賴氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-賴氨酸（ENKPAAPK）”。本研究從海水養(yǎng)殖大菱鲆腸道中篩選具有廣譜抑菌活性的乳酸菌菌株，利用該菌株資源研發(fā)一種生物防腐劑控制水產(chǎn)食品腐敗變質(zhì)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。