鄒宗勝，王婧雅，趙運(yùn)英，毛 銀，鄧 禹*

（江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

纖維素酶是能夠分解纖維素生成葡萄糖的復(fù)合酶的總稱，可以用于動(dòng)物飼料、食品、紡織品、洗滌劑和紙張的制造中[1-2]。在食品工業(yè)中，纖維素酶可廣泛用于果汁和蔬菜汁的澄清、果汁和果泥的生產(chǎn)以及橄欖油的提取等[3]。而在飼料加工過(guò)程中，纖維素酶則可降低粗纖維的含量從而提高牧草的品質(zhì)[4]。

目前，研究較多的產(chǎn)纖維素酶菌種主要為曲霉（Aspergillus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、木霉（Trichoderma sp.）和腐質(zhì)霉（Humicola sp.）等真菌[5]。由于真菌酶系發(fā)達(dá)，產(chǎn)酶效率高，且所產(chǎn)的纖維素酶組成豐富、結(jié)構(gòu)合理，最終使得纖維素酶活力較高；同時(shí)由于真菌產(chǎn)纖維素酶易于分離提取[6]，因此也易于生產(chǎn)放大。在這其中，里氏木霉研究最多，應(yīng)用最廣，里氏木霉是獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的安全無(wú)害菌株，它分泌的纖維素酶穩(wěn)定性好、結(jié)構(gòu)合理、且易于分離純化[7]。陸晨等[8]用里氏木霉RUT-C30進(jìn)行上罐發(fā)酵，96 h時(shí)纖維素酶活最高，達(dá)到3.46 IU/mL。

常壓室溫等離子體誘變（atmospheric room temperature plasma mutation system，ARTP）是一種新型的誘變技術(shù)。等離子體可較易產(chǎn)生，并在室溫和大氣壓下破壞DNA鏈，導(dǎo)致染色體斷裂、重排、缺失并具有DNA損傷修復(fù)抑制。因其具有安全、成本低、操作靈活、突變譜高和突變率高等優(yōu)異特性而在微生物誘變育種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)以里氏木霉RUT-C30為出發(fā)菌株，利用ARTP篩選高產(chǎn)纖維素酶突變菌株，并通過(guò)全基因測(cè)序分析其突變類型。最后，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件來(lái)提高纖維素酶產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

里氏木霉RUT-C30購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心，菌種保藏編號(hào)：GIM 3.536。

剛果紅染料 生工生物工程（上海）股份有限公司；玉米漿 上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

初篩培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g/L，乳糖3 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，剛果紅0.2 g/L，瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，酵母浸膏20 g/L，(NH4)2SO42.5 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO40.8 g/L，CaCl21.0 g/L，Mandels微量元素營(yíng)養(yǎng)鹽1 mL/L[10]，吐溫80 2 mL/L，pH 4.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖18 g/L，微晶纖維素10 g/L，玉米槳粉12 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，MgSO41 g/L，CaCl20.5 g/L，Mandels微量元素營(yíng)養(yǎng)鹽1 mL/L[11]，吐溫80 2 mL/L，pH 4.8。

1.2 儀器與設(shè)備

Artp-iis ARTP誘變系統(tǒng) 無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；SW-CJ-1D無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；MJX-100B-Z霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；BIOTECH-5BG-7000A 5 L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；EPOCH2T酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；LEGEND MICRO 17離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司；Chromaster高效液相色譜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

將PDA斜面保存的里氏木霉RUT-C30孢子用無(wú)菌水洗下，無(wú)菌條件下接種于種子培養(yǎng)基，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)3 d。

5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)：裝液量3 L，接種量10%，通氣量1 L/（L·min），攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，pH 5.0，發(fā)酵周期為6 d，自接種起每12 h取一次樣測(cè)定干質(zhì)量、濾紙酶活以及發(fā)酵液中的乳糖含量。

1.3.2 誘變致死率曲線及正突變率曲線

將斜面上洗下的新鮮孢子用無(wú)菌水稀釋至107～108個(gè)/mL，取0.01 mL菌液均勻地涂在金屬載片上。把裝有樣品的金屬載片平板放到ARTP誘變系統(tǒng)操作室里，照射距離2 mm，逐漸延長(zhǎng)誘變時(shí)間（0、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260 s）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[12]。誘變結(jié)束后，用無(wú)菌鑷子把金屬載片移至裝有1 mL無(wú)菌水的EP管里，迅速振蕩均勻制成新的孢子懸液。將誘變后的孢子懸液適當(dāng)稀釋后均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)豐富的種子培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)4 d后記錄下各平板的菌落數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算誘變致死率，如式（1）所示：

正突變率：相同的稀釋梯度下，將適當(dāng)稀釋的里氏木霉RUT-C30孢子和經(jīng)不同誘變劑量處理后的孢子均勻涂布于初篩平板中。30 ℃培養(yǎng)4 d后計(jì)數(shù)并分別測(cè)量每個(gè)菌落的水解圈與菌落直徑。以對(duì)照組菌落（未經(jīng)誘變）的水解圈與菌落直徑的比值（H/C）為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)突變株H/C大于對(duì)照組H/C的最大值時(shí)記為正突變，小于對(duì)照組H/C的最小值時(shí)記為負(fù)突變。正突變率計(jì)算如式（2）所示：

1.3.3 里氏木霉RUT-C30的ARTP誘變及高產(chǎn)菌株的篩選

在一定的誘變處理時(shí)間條件下對(duì)里氏木霉RUT-C30進(jìn)行誘變操作。將誘變得到的孢子適當(dāng)稀釋涂布于CMC-Na剛果紅平板上，30 ℃培養(yǎng)4 d后根據(jù)水解圈（H/C值）的大小，選擇合適的單菌落，挑取孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)5 d，并以總酶活作為高產(chǎn)菌株的選擇依據(jù)。

1.3.4 菌體干質(zhì)量的測(cè)定

取潔凈的定量濾紙置于烘箱中45 ℃烘干至質(zhì)量恒定后于分析天平內(nèi)記為M1。每次取10 mL發(fā)酵樣品用布氏漏斗抽濾，菌絲用去離子水沖洗兩遍，將該濾紙置于45 ℃烘箱中烘干48 h后于分析天平內(nèi)稱質(zhì)量記為M2[13]。另取10 mL的發(fā)酵液，6 000 r/min離心5 min去上清液，加入3 mL硝酸和醋酸的混合溶液重懸（15 mL純硝酸與150 mL 80%的醋酸的混合溶液）。沸水浴30 min后4 000 r/min離心2 min去上清液，沉淀用去離子水清洗3 遍后45 ℃烘干至質(zhì)量恒定并稱質(zhì)量記為M3[14]。根據(jù)式（3）計(jì)算10 mL發(fā)酵液中的菌絲干質(zhì)量M：

1.3.5 高產(chǎn)纖維素酶突變株的全基因組測(cè)序

高產(chǎn)纖維素酶突變株JNDY-13的測(cè)序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，采用Illumina Genome Analyzer（HiSeq 2500）系統(tǒng)，測(cè)序步驟如Ivanova等[15]所述。研究分析了兩個(gè)獨(dú)立樣本，基因組序列已上傳至SRA，編號(hào)為：SRP124905。

1.3.6 纖維素酶活力活測(cè)定

以濾紙（Whatman Filter Paper No. 1）作為底物測(cè)定纖維素酶總活力：將1 cm×6 cm（50 mg）大小的濾紙條置于裝有1 mL檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 4.8）的試管中作為反應(yīng)底物，然后加入500 μL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的發(fā)酵上清液，空白對(duì)照對(duì)應(yīng)加入500 μL檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 4.8）。將試管置于恒溫振蕩水浴鍋中，50 ℃反應(yīng)1 h，立即加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加入20 mL去離子水，混合均勻后測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度[16]。發(fā)酵培養(yǎng)基中的殘留乳糖通過(guò)高效液相色譜測(cè)定：Bio-Rad HPX-87P 色譜柱，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為5 mmol/L的稀硫酸，檢測(cè)器為視差檢測(cè)器[17]。纖維素酶活力單位（IU）定義：1 個(gè)酶活力單位是指在50 ℃與pH 4.8 的條件下，每分鐘分解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所對(duì)應(yīng)的酶量。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)已有的報(bào)道[18]，設(shè)計(jì)6因素5水平的正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的組分含量進(jìn)行優(yōu)化[19]。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%的接種量轉(zhuǎn)接種子液，30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)6 d，每12 h取樣測(cè)濾紙酶活。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并以濾紙酶活為標(biāo)準(zhǔn)確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

發(fā)酵過(guò)程，主要對(duì)發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速以及通氣量3 個(gè)重要的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后設(shè)計(jì)3因素2水平正交試驗(yàn)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件分別進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，并以濾紙酶活為標(biāo)準(zhǔn)確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.8 流加發(fā)酵

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件和最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行流加發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加乳糖和(NH4)2SO4的混合溶液（乳糖125 g/L，(NH4)2SO427.5 g/L），補(bǔ)加乳糖的總量不超過(guò)50 g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 里氏木霉RUT-C30的ARTP誘變

2.1.1 最佳照射時(shí)間的確定

將里氏木霉RUT-C30的新鮮孢子經(jīng)ARTP 誘變照射不同時(shí)間后涂布于營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基進(jìn)行再生培養(yǎng)，根據(jù)再生單菌落數(shù)計(jì)算致死率，結(jié)果如圖1所示。菌體致死率隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加，當(dāng)照射時(shí)間為200 s時(shí)，菌體致死率達(dá)到98%以上，當(dāng)達(dá)到280 s時(shí)，無(wú)菌體生長(zhǎng)。由正突變率曲線可知，當(dāng)照射時(shí)間為240 s時(shí)正突變率最高為20.1%，故選擇240 s的照射時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 ARTP誘變致死率曲線及正突變率曲線Fig. 1 Lethality curve and positive mutation rate curve of ARTP mutagenesis system

2.1.2 高產(chǎn)菌株的初篩及復(fù)篩

剛果紅是一種染料，它可以與培養(yǎng)基中的纖維素多糖物質(zhì)結(jié)合形成紅色復(fù)合物，但并不會(huì)與纖維二糖、葡萄糖、纖維素酶和纖維素分解菌發(fā)生反應(yīng)[20-21]。根據(jù)水解圈的大小從87 株突變株中獲得20 株產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，由圖2可知，菌株JNDY-13的總酶活力（濾紙酶活）可達(dá)2.21 IU/mL，為出發(fā)菌株里氏木霉RUT-C30的2.21 倍，且該菌產(chǎn)酶經(jīng)10 次傳代仍保持穩(wěn)定，因此選擇JNDY-13進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig. 2 Screening results through shake-f l ask fermentation

2.2 高產(chǎn)纖維素酶突變株JNDY-13的突變分析

為研究高產(chǎn)突變株JNDY-13的遺傳變化，利用Illumina Genome Analyzer（HiSeq 2500）對(duì)其進(jìn)行高通量基因組測(cè)序，并借助MOM算法[22]將Illumina系統(tǒng)產(chǎn)生的序列讀數(shù)與里氏木霉RUT-C30的參考基因組進(jìn)行比對(duì)。對(duì)于JNDY-13，27 934 787 個(gè)（占總數(shù)的94.69%）單端讀數(shù)被繪制，且Illumina測(cè)序的平均深度為123.747。點(diǎn)突變和其他突變事件結(jié)果分析如圖3、4所示，在JNDY-13基因序列中鑒定出752 個(gè)突變，其中18 個(gè)為水解酶類，34 個(gè)為合成酶類，20 個(gè)為激酶，52 個(gè)與能量代謝相關(guān)，73 個(gè)與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)，38 個(gè)與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)，8 個(gè)與生長(zhǎng)相關(guān)，399 個(gè)為假定蛋白，其中110 個(gè)與其他功能相關(guān)。其中，752 個(gè)單核苷酸多態(tài)性中的105 個(gè)被確認(rèn)為點(diǎn)突變，336個(gè)突變?yōu)閴A基缺失，165 個(gè)為堿基插入，99 個(gè)為混合突變。

圖3 JNDY-13高產(chǎn)菌株中的突變組成Fig. 3 Mutation composition of JNDY-13

圖4 JNDY-13高產(chǎn)突變株中突變的類型Fig. 4 Mutation types of JNDY-13

經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，已知相關(guān)的纖維素酶類基因（cel2A、cel3A、cel2B、cel3C、cel5A、cel6A、cel7A、cel7B、cel61A）未發(fā)生突變，關(guān)鍵的調(diào)控因子相關(guān)基因（ace1、ace2、cre1、xyr1）亦未發(fā)生突變。與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞滲透性相關(guān)的基因突變可能對(duì)纖維素酶的分泌產(chǎn)生復(fù)雜的影響，而與轉(zhuǎn)錄翻譯水平、能量代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖密切相關(guān)的突變也可能影響纖維素酶的分泌[23]，Seiboth等[24]研究發(fā)現(xiàn)編碼半乳糖激酶基因的缺失雖不會(huì)影響半乳糖的代謝和里氏木霉在含乳糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，但其基因缺失將對(duì)里氏木霉纖維素酶的產(chǎn)量產(chǎn)生極大影響，這表明半乳糖激酶基因的轉(zhuǎn)錄和纖維素酶產(chǎn)量密切相關(guān)。在JNDY-13中，半乳糖激酶基因的突變發(fā)生在非編碼區(qū)，其中18 個(gè)堿基（GGGTTAAAAAGCGACTCAC）代替半乳糖激酶基因454 bp處的“G”被插入，這可能是其纖維素酶活力發(fā)生改變的原因。

2.3 纖維素酶高產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶優(yōu)化

2.3.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

培養(yǎng)基的組分、配比和緩沖能力等都對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶具有重要的影響[13]。本研究中，在他人研究的基礎(chǔ)上[18]，根據(jù)篩選獲得的高產(chǎn)菌株特性，設(shè)計(jì)6因素5水平的正交試驗(yàn)（表1）對(duì)培養(yǎng)基的組分（乳糖、微晶纖維素、玉米漿、CaCl2、(NH4)2SO4、MgSO4）用量在搖瓶中進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行極差分析。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of fermentation medium

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，6 種培養(yǎng)基組分中玉米漿對(duì)產(chǎn)酶的影響最大，(NH4)2SO4次之，再次依次為乳糖、CaCl2、MgSO4和微晶纖維素。優(yōu)化過(guò)的產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為：乳糖10 g/L、微晶纖維素10 g/L、玉米漿粉12 g/L、(NH4)2SO41.5 g/L、MgSO41.2 g/L、CaCl21.4 g/L、Mandels微量元素營(yíng)養(yǎng)鹽1 mL/L、吐溫80 2 mL/L，pH 4.8。利用此培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶活力最高可達(dá) 2.64 IU/mL，高于原始培養(yǎng)基的產(chǎn)酶活力（2.21 IU/mL）。

2.3.2 5 L罐發(fā)酵條件優(yōu)化

采用上述優(yōu)化過(guò)的培養(yǎng)基，按照以下條件（裝液量為3 L，接種量10%，通氣量1 L/（L·min），攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵溫度28 ℃，pH 5.0）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先通過(guò)單因素方法研究了對(duì)產(chǎn)酶影響較大的因素（通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度），而后通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，并最終利用獲得的最優(yōu)發(fā)酵條件對(duì)高產(chǎn)菌株JNDY-13進(jìn)行分批發(fā)酵。由于纖維素酶的不同組分分別有不同的最佳產(chǎn)酶pH值，且主要集中在4.0～6.0之間，為保持實(shí)驗(yàn)的一致性，本實(shí)驗(yàn)中均采用pH 5.0進(jìn)行研究[25-27]。

2.3.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有重要的影響，當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢；而發(fā)酵溫度過(guò)高時(shí)雖菌體生長(zhǎng)迅速但產(chǎn)酶量卻會(huì)偏低[28]。張曉煊等[29]研究發(fā)現(xiàn)里氏木霉在28～30 ℃培養(yǎng)可獲得較高的濾紙酶活，低于25 ℃或高于33 ℃時(shí)酶活力下降比較顯著。由于里氏木霉產(chǎn)酶的最佳溫度為28 ℃，而該菌株生長(zhǎng)的最佳溫度為30 ℃[30]，因此本實(shí)驗(yàn)以濾紙酶活為唯一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)發(fā)酵溫度28 ℃和30 ℃分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)產(chǎn)酶活力最高，可達(dá)4.33 IU/mL，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27]。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Cellulase production curves at different fermentation temperatures

2.3.2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

保持其他參數(shù)不變，設(shè)定不同的攪拌轉(zhuǎn)速，以濾紙酶活為唯一指標(biāo)對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí)，發(fā)酵液中的溶氧水平明顯增加，發(fā)酵前期菌體量迅速增加，至發(fā)酵中期時(shí)發(fā)酵液逐漸變清，表明菌絲大量死亡，且由圖6可知，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí)最高濾紙酶活僅為1.22 IU/mL，表明攪拌轉(zhuǎn)速太高時(shí)，雖然溶氧水平得以提高但是相應(yīng)的剪切力也大大增加。發(fā)酵前期菌絲體強(qiáng)壯，而到了發(fā)酵中期時(shí)菌絲體老化對(duì)剪切力敏感，因此導(dǎo)致菌體大量死亡并使總酶活迅速降低[31]。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，溶氧自對(duì)數(shù)期起均處于較低水平，由于菌絲生長(zhǎng)緩慢使得到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間明顯延長(zhǎng)而不利于產(chǎn)酶。姜伯玲[32]發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)速較低時(shí)，發(fā)酵體系中的溶氧不足，從而影響菌絲體的生長(zhǎng)代謝，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。而當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，既能基本保證菌體生長(zhǎng)所需溶氧，又不會(huì)對(duì)菌絲造成太大的損傷，使得其最高酶活可達(dá)4.51 IU/mL。張素敏[33]對(duì)里氏木霉T306進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，既能保證菌株的溶氧需求，又不會(huì)顯著損傷菌體，本研究中得到的結(jié)果與其報(bào)道一致。

圖6 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig. 6 Cellulase production curves at different stirring speeds

2.3.2.3 通氣量對(duì)產(chǎn)酶的影響

溶氧水平對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都至關(guān)重要，且溶氧水平又與通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速密切相關(guān)[34-35]。在攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)通氣量進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。由圖7可知，當(dāng)通氣量為2 L/（L·min）時(shí)，最高濾紙酶活可達(dá)4.44 IU/mL；而當(dāng)通氣量為1 L/（L·min）時(shí)，最高濾紙酶活為3.72 IU/mL。

圖7 不同通氣量下的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig. 7 Cellulase production curves at different ventilation fl ow rates

2.3.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

表2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of fermentation conditions

根據(jù)優(yōu)化過(guò)的產(chǎn)酶培養(yǎng)基以及上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表2）對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min、通氣量2 L/（L·min）、pH值恒定為5.0。發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶影響最大，其次是攪拌轉(zhuǎn)速，再次是通氣量。根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果，對(duì)里氏木霉JNDY-13進(jìn)行分批發(fā)酵，結(jié)果如圖8所示，在最優(yōu)條件下進(jìn)行分批發(fā)酵最高濾紙酶活可達(dá)4.74 IU/mL，最高菌體量可達(dá)8.91 g/L，且培養(yǎng)基中的乳糖在前36 h即消耗殆盡。

圖8 分批發(fā)酵結(jié)果Fig. 8 Time courses of fed-batch fermentation

2.3.3 流加發(fā)酵

圖9 流加發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶Fig. 9 Production of cellulase through fed-batch fermentation

采用最優(yōu)條件進(jìn)行流加發(fā)酵，即自36 h起，每12 h流加一次乳糖和(NH4)2SO4的混合溶液（碳氮比10∶1），發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充乳糖的總量不超過(guò)50 g/L。由圖9可知，流加發(fā)酵時(shí)最高濾紙酶活可達(dá)5.40 IU/mL，菌體量最高可達(dá)9.19 g/L。將流加發(fā)酵結(jié)果與分批發(fā)酵結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，二者纖維素酶產(chǎn)量的最高點(diǎn)都集中在發(fā)酵前期以及中期，而到發(fā)酵中后期產(chǎn)酶量均逐漸下降。這一現(xiàn)象表明本實(shí)驗(yàn)獲得的最佳發(fā)酵條件相對(duì)較適合菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶，但仍未達(dá)到最佳要求，這可能與發(fā)酵中期發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)情況和蛋白酶的大量分泌有關(guān)。下一步工作中，可篩選蛋白酶分泌水平較低的高產(chǎn)菌株，并對(duì)發(fā)酵中期發(fā)酵罐中的各種因素如溶氧水平、菌體密度、活菌比例、殘?zhí)呛团囵B(yǎng)基中蛋白酶活力等進(jìn)行具體分析，指導(dǎo)進(jìn)一步的發(fā)酵優(yōu)化。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)常溫室壓等離子體技術(shù)誘變里氏木霉RUT-C30，成功獲得1 株纖維素酶高產(chǎn)菌株JNDY-13，搖瓶初篩其最高濾紙酶活可達(dá)2.21 IU/mL，為出發(fā)菌株里氏木霉RUT-C30的2.21 倍。

為研究高產(chǎn)突變株JNDY-13的遺傳變化，進(jìn)行全基因組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示共有752 個(gè)突變，其中18 個(gè)為水解酶類，34 個(gè)為合成酶類，20 個(gè)為激酶，52 個(gè)與能量代謝相關(guān)，73 個(gè)與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)，38 個(gè)與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)，8 個(gè)與生長(zhǎng)相關(guān)，399 個(gè)為假定蛋白，其中110 個(gè)與其他功能相關(guān)。發(fā)現(xiàn)752 個(gè)突變中含有105 個(gè)點(diǎn)突變，336 個(gè)為堿基缺失，165 個(gè)為堿基插入，以及99 個(gè)為混合突變。

突變菌株經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化，最高酶活可達(dá)5.40 IU/mL，菌體量最高可達(dá)9.19 g/L，且經(jīng)10 次傳代該菌株依然有較高纖維素酶活力。