谷春梅，尹佳玉，姜 雷

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

玉米皮是玉米淀粉和玉米蛋白質(zhì)加工的副產(chǎn)物，也被稱為玉米纖維，產(chǎn)量占玉米干質(zhì)量的14%[1]。目前，很多企業(yè)只將其用作飼料或廢棄，造成很大的資源浪費。玉米皮作為清潔易得的農(nóng)產(chǎn)品下腳料，是開發(fā)食品組分的豐富資源[2]。專家學(xué)者已對玉米皮中的功能性成分進(jìn)行了大量的研究工作，但對于酶法提取阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）的研究較少[3-7]。

玉米皮細(xì)胞含有大量的纖維素、半纖維素、較多的酚酸以及少量的蛋白質(zhì)。AX是玉米皮半纖維素雜木聚糖中的主要多糖。AX的基本結(jié)構(gòu)是以(1→4)-β-D-吡喃木糖殘基聚合而成的線型主鏈。側(cè)鏈主要通過C(O)-2或C(O)-3鍵連接阿拉伯呋喃糖基或通過C(O)-2和C(O)-3同時連接阿拉伯呋喃糖基。玉米皮AX的另一結(jié)構(gòu)特點是其分子上連接大量的酸性基團(tuán)，其中直接與主鏈連接的是醋酸，與阿拉伯呋喃糖基連接的是對羥基桂皮酸、阿魏酸。這些活性基團(tuán)可參與重要的化學(xué)反應(yīng)[8-10]。

谷物麩皮中AX的提取方法有多種，其中化學(xué)試劑提取法提取率高，但由于此方法中使用大量的酸和堿，存在提取物的食用安全性低、對活性基團(tuán)保留率低、價格高、環(huán)境污染重、對設(shè)備要求高等問題，僅適用于實驗室進(jìn)行小規(guī)模實驗[11-12]；而生物技術(shù)特別是酶法提取技術(shù)則因其條件溫和、綠色無污染、能最大限度地回收有效成分，代表了AX加工技術(shù)的發(fā)展方向[13-15]。

本研究以鮮玉米麩皮為原料，采用酶法提取玉米皮AX，用食品工業(yè)中常用的4種木聚糖酶Grindmyl Powerbake 950、Pentopan mono BG、Viscozyme L及Amano HC 90提取不同時間，研究提取物的提取率、單糖組成及分子質(zhì)量分布，篩選出1 種對玉米皮中AX提取效果較好的商業(yè)木聚糖酶，并確定其最適添加量，以期為玉米加工副產(chǎn)物的綜合利用及玉米皮AX的分離純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮玉米麩皮（為鮮榨玉米汁副產(chǎn)物） 吉林天景食品有限公司；樺木木聚糖、D-(+)-半乳糖、D-(+)-木糖及D-(+)-葡萄糖 美國Sigma公司；阿洛糖 美國Miragen公司；L-(+)-阿拉伯糖、D-(+)-甘露糖及L-(+)-鼠李糖 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；其他試劑均為分析純。

酶制屬Aspergillus aculeatus菌株生產(chǎn)，其中包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶和劑：Grindmyl Powerbake 950（簡稱G，由細(xì)菌發(fā)酵，是一種純化的內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶） 丹尼斯克（中國）有限公司；Pentopan mono BG（簡稱P，由米曲霉菌Aspergillus oryzae經(jīng)深層發(fā)酵制得，是一種純化的內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶）和Viscozyme L（簡稱V，由曲霉木聚糖酶等發(fā)酵制得） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；Amano HC 90（簡稱HC，由黑曲霉Aspergillus niger菌株生產(chǎn)，除含有木聚糖酶外，還含有纖維素酶、β-糖苷酶、果膠酶等） 天野酶制劑（江蘇）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-14C型氣相色譜儀 日本島津公司；高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）儀 美國懷雅特公司；十二聯(lián)平行發(fā)酵系統(tǒng) 匯能達(dá)生物工程設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠；3K15型高速冷凍離心機(jī)美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮玉米麩皮的前處理

參照胡葉碧的方法，略作改動[16]。

鮮玉米麩皮經(jīng)自來水沖洗至水澄清，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中，90 ℃烘干。將烘干的鮮玉米麩皮粉碎，過20 目篩網(wǎng)，并在121 ℃高壓滅菌20 min，于-20 ℃冰箱保存。

上述鮮玉米麩皮中加入0.05 mol/L，pH值為6.5的磷酸緩沖液（1∶7，g/mL），室溫條件下溶脹18 h，放置水浴鍋中，將溫度調(diào)節(jié)至75 ℃，以鮮玉米麩皮計加入淀粉酶（10 μL/g），攪拌反應(yīng)1 h，將溫度調(diào)節(jié)至60 ℃，以鮮玉米麩皮計加入高轉(zhuǎn)化率糖化酶（4 μL/g），攪拌反應(yīng)30 min，以鮮玉米麩皮計加入堿性蛋白酶（100 μL/g），攪拌反應(yīng)4 h，100 ℃水浴中加熱10 min滅酶，以去離子水邊沖洗邊抽濾，至去離子水清澈，將濾渣放入鼓風(fēng)干燥箱中，70 ℃干燥，即得去淀粉去蛋白質(zhì)鮮玉米麩皮（destarched and deproteinised fresh maize bran，DSDPB）。

1.3.2 木聚糖酶活力測定

采用胡葉碧等的方法[17]。

酶與緩沖液充分混勻（1∶100，g/mL），室溫攪拌30 min，8 000 r/min離心20 min，上清液備用。

以樺樹木聚糖為底物，酶與底物共3.5 mL，充分混勻，在酶的最適反應(yīng)條件下（Grindmyl Powerbake 950在50 mmol/L pH 5.0的NaAc緩沖液中，最適溫度為40 ℃；Pentopan mono BG在50 mmol/L pH 5.0的NaAC緩沖液中，最適溫度為55 ℃；Amano HC 90在50 mmol/L pH 4.5的NaAC緩沖液中，最適溫度為50 ℃；Viscozyme L在50 mmol/L pH 4.5的NaAc緩沖液中，最適溫度為45 ℃），反應(yīng)15 min，沸水浴中加熱10 min滅酶，DNS法測定反應(yīng)液中還原糖的含量，用標(biāo)準(zhǔn)木糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以每分鐘催化木聚糖生成1 μmol還原糖所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.3 鮮玉米麩皮中AX的酶法提取

參照蔣琦霞等的方法[18]，略作改動。

將DSDPB與緩沖液以一定比例混合（1∶30，g/mL），以DSDPB計，分別加入200 U/g的4 種商業(yè)木聚糖酶，于十二聯(lián)平行發(fā)酵系統(tǒng)中，分別在每種酶的最適條件下（同1.3.2節(jié)）攪拌反應(yīng)1、4 h及24 h，100 ℃水浴中加熱10 min滅酶，離心，上清液濃縮后，冷凍干燥，備用。AX提取率按如下公式計算：

1.3.4 單糖組成測定

參照Craeyveld[19]和Delcour[20]等的方法，略作改動。上述鮮玉米皮酶法提取物用2.5 mL，4.0 mol/L三氟乙酸在110 ℃水解60 min，水解液用NaBH4還原，用醋酸酐酯化，用于氣相色譜法測定單糖組成。采用30 m Supelco SP-2380柱（內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.2 μm）。

進(jìn)樣條件：載氣，N2；進(jìn)樣量4.0 μL；進(jìn)樣溫度280 ℃；檢測溫度280 ℃；程序升溫：初始溫度100 ℃，2 min；1 ℃/min升至110 ℃，維持1 min；5 ℃/min升至115 ℃；1 ℃/min升至118 ℃；25 ℃/min升至175 ℃；1 ℃/min升至220 ℃，維持5 min；10 ℃/min降至100 ℃，維持2 min。以β-D-阿洛糖為內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)法結(jié)合峰面積法計算單糖含量。AX含量以阿拉伯糖與木糖含量之和乘0.88計。

1.3.5 分子質(zhì)量分布的測定

參照Escarnot等[21]的方法，略作改動。鮮玉米皮提取物溶于蒸餾水，經(jīng)5 μm微孔濾膜過濾，取濾液進(jìn)入HPSEC進(jìn)行分析，進(jìn)樣量100 μL，洗脫溫度55 ℃，洗脫液流速0.5 mL/min；采用Version 5.3.4.14ASTRA軟件分析鮮玉米皮酶法提取物的重均分子質(zhì)量（mw）及數(shù)均分子質(zhì)量（mn）。

1.3.6 Amano HC 90最適添加量的確定

將DSDPB與緩沖液以一定比例混合（1∶30，g/mL），以DSDPB計，分別加入50、100、400、550、700、850、1 000、1 500、2 000 U/g Amano HC 90，于十二聯(lián)平行發(fā)酵系統(tǒng)中，最適條件下4 h、100 ℃水浴中加熱10 min滅酶，離心，上清液濃縮后，冷凍干燥，以提取率和提取物中AX含量為指標(biāo)，確定Amano HC 90的添加量。

1.4 統(tǒng)計分析

采用至少2 次實驗結(jié)果的 ±s表示，使用SPSS statistics version 17.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法提取物的組成

采用酶法提取玉米皮AX，其單糖組成主要是阿拉伯糖和木糖，此外還有少量的葡萄糖、半乳糖和甘露糖；其各單糖組分的含量受酶的種類的影響而產(chǎn)生變化。本研究采用4 種食品工業(yè)中常用的木聚糖酶提取鮮玉米皮中的AX，在各木聚糖酶的最適作用條件下提取1、4、24 h，提取物的組成如表1所示。

表1 不同種類酶提取玉米皮AX的相關(guān)指標(biāo)Table 1 Effect of different xylanases on monosaccharide composition,purity and yield of araboxylan

由表1可知，采用4 種木聚糖酶提取玉米皮AX，1 h后提取率均明顯增加（P＜0.05）。對于G和HC，提取4～24 h時，提取率增加不明顯。經(jīng)4 種酶分別酶解玉米皮24 h所提取玉米皮AX提取率由高到低為V＞HC＞G＞P，分別為（27.88±2.48）%、（17.37±2.74）%、（15.08±0.69）%、（2.00±0.00）%；提取物的單糖組成，對于P，提取1～24 h，提取物中AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5.7%增加到21.89%；對于V，AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)由30.51%增加到62.18%；對于G，提取物中AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)由8.81%增加到44.21%；對于HC，AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)從31.61%增加到78.63%。因此，采用HC提取，提取物中AX含量較高。

木聚糖酶是采用酶法提取AX的主要酶制劑。木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系，它能打破木聚糖主鏈，隨機(jī)清除內(nèi)部β-(1,4)-糖苷鍵。木聚糖酶的種類很多，且不同來源的木聚糖酶在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上也會有較大差別，因此采用不同的木聚糖酶在相同的工藝條件下處理玉米皮對AX的提取率和純度會造成較大影響。從氣相色譜分析結(jié)果看，V的提取率最大，而HC的提取物中AX含量最高，可能是受木聚糖酶特性的影響。

胡葉碧[16]采用酶法制備的粗玉米皮膳食纖維的主要組成單糖是木糖和阿拉伯糖，還有部分的甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及少量的鼠李糖，在不溶性膳食纖維中AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.92%，水溶性膳食纖維中AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.90%。李勤勤等[22]采用酸堿處理得到的酸解產(chǎn)物和堿解產(chǎn)物的單糖組成主要是木糖和阿拉伯糖，還有少量的葡萄糖、半乳糖和甘露糖；其中經(jīng)酸處理得到的AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.37%，經(jīng)堿處理得到的AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)為89%。過嫣丹[23]采用堿-過氧化氫法從玉米麩皮中提取AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)為89.37%，其單糖組成阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和鼠李糖。本研究采用酶法提取的玉米皮中AX的單糖組成（圖1）與化學(xué)法的相比較，其主要差別在于含量較少的組分，比如甘露糖和鼠李糖，各單糖組分的比例變化較大；在本研究中采用不同種類酶提取的AX的各單糖組分的含量不同，這與胡葉碧的研究結(jié)果——木聚糖酶將膳食纖維中的不溶性成分降解為可溶性物質(zhì)，在增加可溶性膳食纖維的同時也明顯的改變了其化學(xué)組成的結(jié)論相一致。

評價AX結(jié)構(gòu)特點的一個重要指標(biāo)為木聚糖主鏈的平均取代度[24]。主鏈平均取代度可以反映AX的取代程度，即側(cè)鏈阿拉伯糖含量的多少，其含量的不同說明其AX具有不同的功能特性。從表1可以看出，玉米皮經(jīng)酶解后所得AX的Ara/Xyl由高到低為G＞V＞HC＞P，比值分別為0.72、0.65、0.63、0.60，均無顯著差異。可見得出采用木聚糖酶酶解玉米皮所得到的AX在主鏈上的取代方式無顯著差異。

圖1 不同種類酶提取玉米皮AX的單糖組成分析Fig. 1 Monosaccharide compositions of maize bran arabinoxylans extracted with different xylannases

目前，對于谷物中AX的提取主要集中于麥麩麩皮，科研人員對其不同的提取方法進(jìn)行了廣泛的研究[25-27]。與麥麩中AX分子結(jié)構(gòu)相比，玉米皮中AX的分子上側(cè)鏈的種類、數(shù)量、側(cè)鏈的長度及取代方式較復(fù)雜，且分子上連接阿魏酸、醋酸及羥基桂皮酸等活性基團(tuán)，會使分子間發(fā)生更為復(fù)雜的氧化交聯(lián)，致使其提取率降低。目前針對玉米皮AX的提取主要集中在化學(xué)試劑提取法，宋琳琳等[28]采用正交設(shè)計的方法對玉米皮AX的堿提工藝進(jìn)行優(yōu)化，最高得率為24.57%。劉靜等[29]采用堿-過氧化氫法從玉米麩皮中提取AX，其提取率最高為27.85%。本研究采用酶法提取玉米皮中的AX，提取率最高為17.37%，雖然其提取率較化學(xué)試劑提取法低，但酶法提取有成本低、操作安全、對環(huán)境友好的優(yōu)點，同時也可通過協(xié)同其他方法來提高其提取率，說明酶法提取更適于工業(yè)生產(chǎn)。

2.2 酶法提取物的分子質(zhì)量分布

木糖通過β-1,4糖苷鍵鏈接形成木聚糖，構(gòu)成玉米皮AX的骨架，AX作為側(cè)鏈連接在骨架上。木聚糖酶酶解玉米皮AX時將會作用于木聚糖骨架上任意位置的β-1,4-D-呋喃木糖鍵，從而得到分子質(zhì)量不一的片段。

本研究對4 種食品工業(yè)中常用的木聚糖酶提取鮮玉米皮所得到的AX進(jìn)行分子質(zhì)量（mw、mn和mw/mn）分布的測定，結(jié)果如圖2及表2所示。

圖2 玉米皮經(jīng)不同種類酶提取不同時間所得AX的分子質(zhì)量分布Fig. 2 HPSEC analysis of molecular mass distribution of araboxylans extracted with different xylannases

由圖2可知，P、G、V及HC提取物HPSEC圖譜有3 個峰，說明水解物分子質(zhì)量主要有3 個分布范圍。對于P，隨著提取時間延長，3 個峰的高度變化很小，P提取物中各分子質(zhì)量分布范圍內(nèi)的AX較少，這與2.1節(jié)結(jié)果一致；V隨著提取時間的延長，水解物HPSEC圖譜的第1個峰明顯增大，說明隨著提取時間的延長，玉米皮中大分子質(zhì)量的AX增多；對于HC，隨著提取時間的延長，提取物HPSEC圖譜的第1個峰增大最為明顯，表明采用HC提取得到的大分子質(zhì)量的組分量最多。

表2 不同種類酶提取玉米皮所得AX的分子質(zhì)量分布Table 2 Effect of different xylannases on molecular mass distribution of araboxylan

由表2可知，在相同的提取時間，4 種食品工業(yè)中常用的木聚糖酶提取鮮玉米皮所得到AX的分子質(zhì)量分布差異較大。將經(jīng)酶處理與未經(jīng)酶處理所得AX相比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)V和G兩種酶處理之后的相對分子質(zhì)量分散系數(shù)顯著高于未經(jīng)酶處理的（P＜0.01），分別為19.73±1.00和21.45±1.18，所得到的AX的mw較小，分別為（28.74±1.31）×104g/mol和（38.77±2.23）×104g/mol，說明經(jīng)該酶處理之后所得AX分子質(zhì)量分布不均勻，獲得的高分子質(zhì)量AX的種類在增加，兩種酶的使用有利于低分子質(zhì)量阿拉伯木聚糖的溶出；經(jīng)P和HC處理之后，其相對分子質(zhì)量分散系數(shù)顯著低于未經(jīng)酶處理的（P＜0.01），分別為10.32±1.47和4.51±0.13，所得到AX的mw分別為（89.34±0.01）×104g/mol和（67.87±1.46）×104g/mol，說明其分子質(zhì)量均勻程度增加，獲得的低分子質(zhì)量AX的種類在增加，兩種酶的使用有利于高分子質(zhì)量AX的溶出。由上可知，在經(jīng)HC提取鮮玉米皮所得到的AX是高分子質(zhì)量且分子質(zhì)量分布均勻的AX。

多糖的性質(zhì)與其分子質(zhì)量大小、分子質(zhì)量分布及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。過嫣丹[23]采用堿-過氧化氫法從玉米麩皮中提取AX，測得其相對分子質(zhì)量為5.72×105。Buchanan等[30]采用堿法從玉米皮中提取高分子的水溶性AX，其相對分子質(zhì)量在5×105以上。劉靜等[29]采用堿-過氧化氫法從玉米麩皮中提取AX，在最佳提取條件下其相對分子質(zhì)量為3.36×105。將本研究采用酶法提取得到的玉米皮AX的分子質(zhì)量與化學(xué)法相比，其差異性與木聚糖酶的種類有關(guān)，且采用不同種類酶對玉米麩皮中AX進(jìn)行提取，其分子質(zhì)量分布與未加酶提取的相比較有所減小，這說明木聚糖酶將部分分子質(zhì)量大的分子降解成了分子質(zhì)量較小的分子，而分子質(zhì)量減小程度的不同，則說明不同種類的木聚糖酶的降解能力不同。

綜上，在木聚糖酶添加量相同的條件下，提取物的單糖組成及分子質(zhì)量分布的差別主要受酶制劑中存在的其他酶活性如纖維素酶、β-葡聚糖酶等活性及其比例影響[21]。

2.3 Amano HC 90添加量對提取率和提取物中AX含量的影響

圖3 Amano HC 90最適添加量對提取率和提取物中AX含量的影響Fig. 3 Effect of Amano HC 90 dosage on yield and purity of AX

從圖3可以看出，隨著Amano HC加酶量的增加，提取率和提取物中AX含量均增加，當(dāng)加酶量增加到550 U/g時，提取物中AX含量不再增加；當(dāng)加酶量增加至1 500 U/g時，提取率達(dá)到最大，此后不再增加。因此確定Amano HC的最適添加量為1 500 U/g。

3 結(jié) 論

本研究采用酶法提取玉米皮AX可得到較好的提取率和純度，通過對4 種食品工業(yè)中常用的木聚糖酶酶解玉米皮的結(jié)果進(jìn)行比較，得出結(jié)論如下：1）V的提取率最大，而HC的提取物中AX含量最高；2）采用HC提取得到的大分子質(zhì)量的組分量最多，且重均分子質(zhì)量和數(shù)均分子質(zhì)量較大；3）Amano HC較適用于提取鮮玉米麩皮中較大分子質(zhì)量的AX，其最適添加量為1 500 U/g。通過對酶法提取玉米AX的木聚糖酶進(jìn)行篩選，為后期對酶法提取玉米皮AX進(jìn)行工藝優(yōu)化提供一定的基礎(chǔ)。