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(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002)

脂質(zhì)代謝紊亂是肥胖、糖尿病、高血脂和非酒精性脂肪肝等的主要危險(xiǎn)因素之一[1]。高血脂是一種以升高血液中膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和降低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)為特點(diǎn)的脂質(zhì)代謝疾病[2]。許多證據(jù)表明:腸道菌群與脂質(zhì)代謝之間存在著密切的關(guān)系[3]。腸道菌群是由數(shù)萬億細(xì)菌組成的復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng),被認(rèn)為是一種隱藏的代謝器官[4]。長期食用高脂食品可以改變腸道菌群的整體結(jié)構(gòu),增加脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前,治療脂質(zhì)代謝紊亂藥物以他汀類為主,然而長期服用他汀類藥物,易產(chǎn)生各種不良反應(yīng)[6]。因此,尋求天然活性物質(zhì)對改善脂質(zhì)代謝紊亂成為研究熱點(diǎn)。

天然三萜類化合物具有廣泛的生物活性[7]。三萜類化合物主要存在于雙子葉植物,其中游離三萜類主要分布在豆科、魯賓科和唇形科等植物[8]。目前,三萜化合物的活性研究主要圍繞抗氧化、護(hù)肝、抑制腫瘤和提高免疫力方面[9]。李森等人從澤瀉中分離出三萜能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)高血脂癥小鼠的血脂水平[10],但關(guān)于靈芝三萜的降血脂活性及其調(diào)節(jié)腸道菌群的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明靈芝55%醇提物富含三萜類物質(zhì),主要包括15種化合物[11]。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)Wistar大鼠形成脂質(zhì)代謝紊亂模型,觀察靈芝55%醇提物對脂質(zhì)代謝紊亂大鼠糞便菌群的影響,初步探討靈芝55%醇提物預(yù)防脂質(zhì)紊亂的可能性作用機(jī)制,為進(jìn)一步開發(fā)治療高脂飲食引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

基礎(chǔ)飼料 福建省福州市吳氏實(shí)驗(yàn)動物提供;高脂飼料 參照羅喜鋼的飼料配方[12];靈芝 采購于福建農(nóng)林大學(xué)國家工程技術(shù)研究中心;無水乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;TG、TC、HDL-C和LDL-C試劑盒 南京建成科技有限公司;10%水合氯醛 購于福州總院;清潔級Wistar大鼠24只(170±20) g 購于山東省實(shí)驗(yàn)動物中心(No.SCXK2017-0005)。

日立7060全自動生化分析儀 日立有限公司;電子天平 深圳市德優(yōu)平科技有限公司;低溫高速離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;-80 ℃冰箱 青島海爾股份有限公司;熒光定量PCR 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;酶標(biāo)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝醇提物制備 靈芝子實(shí)體在70 ℃干燥后,粉碎過60目,按料液比為1∶30加入95%乙醇,在60 ℃下浸泡120 min后過濾。取濾渣按1∶30加入55%乙醇,在60 ℃下浸泡120 min后過濾,減壓濃縮,冷凍干燥,備用。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)使用此提取方法提取靈芝醇提物的提取率較高[11]。

1.2.2 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 大鼠經(jīng)過7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將實(shí)驗(yàn)動物任意平分為3組,分別為:空白組(基礎(chǔ)飼料,NFD)、模型組(高脂飼料,HFD)和干預(yù)組(高脂飼料+150 mg/kg·d靈芝55%醇提物,GLE),每次灌胃2 mL,喂養(yǎng)8周。在實(shí)驗(yàn)第4周和第8周時(shí),早上8點(diǎn)開始收集老鼠糞便,并保存于-80 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天,禁食12 h,利用10%水合氯醛對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行麻醉,采用心臟取血方式收集血液,并迅速取出肝臟用液氮速凍,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 血清及肝臟生化指標(biāo)檢測 采用心臟采血,室溫條件下靜置30 min,4000 r/min離心10 min,取上清液。利用全自動生化分析儀對大鼠血清生化指標(biāo)(TG、TC、LDL-C和HDL-C)進(jìn)行檢測。

稱取100 mg 肝臟組織置于2 mL離心管,用生理鹽水洗掉表面雜質(zhì),再按重量體枳比1∶9加入生理鹽水,用眼科剪刀將肝臟組織剪碎,然后將其插入冰中,使用組織勻漿機(jī)對其組織進(jìn)一步破碎,離心(9500 r/min,5 min),取上清,測定TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。

1.2.4 肝臟中RNA提取及RT-PCR反應(yīng) 肝臟RNA的提取參照易凡琪等[13]的提取方法,并使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,-80 ℃保存。最后以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,按照Takara試劑盒要求進(jìn)行擴(kuò)增,通過檢測SYBR Green I熒光強(qiáng)度,達(dá)到監(jiān)控其產(chǎn)物增量的目的,采用2-ΔΔCt值法計(jì)算與NFD組的相對表達(dá)量。其引物設(shè)計(jì)如表1:

表1 基因和引物序列Table 1 Gene and sequences of primers

1.2.5 糞便菌群總DNA提取和高通量測序分析 利用試劑盒提取大鼠糞便中總DNA,并在低溫條件下送往上海態(tài)昌基因科技有限公司,對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增及高通量測序。

針對16S RNA基因中V3～V4區(qū),合成帶有的特異引物(正向引物:5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3′,反向引物:5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)。然后產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上觀察,然后用Axygene DNA凝膠提取試劑盒(Corning,NY)進(jìn)行純化,將PCR產(chǎn)物歸一化后,后續(xù)測序由上海態(tài)昌基因科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝提取物(GLE)對高脂大鼠血液生化指標(biāo)的影響

由表2可知,與NFD組相比,高脂膳食大鼠血清中TG、TC和LDL-C水平極顯著性升高(p<0.01),而極顯著性降低HDL-C水平(p<0.01)。研究表明,血清中膽固醇每降低1%,患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)降低2%～3%[14],而LDL-C升高會增加突發(fā)性心血管疾病的發(fā)病率[15]。此外,HDL-C降低易引發(fā)冠心病[16]。與HFD組相比,口服GLE能顯著降低血清中TG、TC和LDL-C的水平(p<0.05),而HDL-C水平變化并無顯著差異(p>0.05)。說明靈芝55%醇提物能有效改善高血脂癥大鼠的血液生化指標(biāo)(除HDL-C外)。

表2 靈芝提取物對高脂飲食大鼠血脂的影響Table 2 Effect of GLE on blood lipid in high-fat diet fed

2.2 靈芝提取物(GLE)對高脂大鼠肝臟指數(shù)的影響

肝臟是人體脂質(zhì)代謝重要的器官,肝臟中TG、TC、HDL-C和LDL-C水平能有效反映肝臟狀態(tài)。與NFD組相比(圖1),HFD組中大鼠肝臟中TG、TC和LDL-C水平均顯著升高(p<0.01),而與HFD組相比補(bǔ)充GLE均能得到顯著降低(p<0.05)。肝臟中TC含量降低可能是過量的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外[17]。此外,高脂飲食會降低肝臟中HDL-C水平(p<0.01),但口服GLE能使HDL-C水平接近空白組(p>0.05)。

圖1 靈芝提取物對高脂飲食大鼠肝指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of GLE on the hepatic TG,TC,HDL-C and LDL-C levels in high-fat diet fed rats注：##表示與空白組相比差異極顯著(p<0.01),#表示與空白組相比差異顯著(p<0.05); **表示與模型組相比差異極顯著(p<0.01),*表示與模型組相比差異顯著(p<0.05)，圖2同。

2.3 靈芝提取物(GLE)對相對mRNA表達(dá)量的影響

由圖2可知,與NFD組比較,HFD組大鼠肝組織中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的過氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPARα)mRNA表達(dá)量極顯著下調(diào)(p<0.01),同時(shí)顯著增加固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1C)(p<0.05),極顯著增加了載脂蛋白B(ApoB)的表達(dá)量(p<0.01)。PPARα可增加脂肪酸的氧化,進(jìn)而減少肝臟中脂質(zhì)積累[18]。此外,PPARα可有效提高血漿HDL-C水平,降低動脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[19]。與模型組比較,靈芝提取物可極顯著提高PPARα表達(dá)水平(p<0.01),減少脂質(zhì)在肝臟中的積累。SREBP-1c主要負(fù)責(zé)ACC1基因在肝臟中的表達(dá),進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)血液中TG水平[20]。ApoB水平的升高,會導(dǎo)致血清中TG 水平的上升,引發(fā)高膽固醇血癥[21]。靈芝提取物也極顯著抑制高脂膳食誘導(dǎo)ApoB水平升高(p<0.01),使ApoB表達(dá)水平接近空白組(p>0.05)。

圖2 靈芝提取物對高脂飲食大鼠相對mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of GLE on relative expression of mRNA in high-fat diet fed rats

2.4 靈芝提取物(GLE)對菌群結(jié)構(gòu)的影響

由圖3A可知,同一實(shí)驗(yàn)組第4周和第8周處于同一小類,說明同一實(shí)驗(yàn)組的不同時(shí)期的菌群結(jié)構(gòu)具有較高相似性。由聚類分析可知,GLE組中糞便菌群結(jié)構(gòu)與HFD組菌群結(jié)構(gòu)處于同一大類。但GLE組處于NFD和HFD組之間,說明GLE菌群結(jié)構(gòu)存在向空白組變化的趨勢。由圖3B的主成分分析可知,空白組和模型組分別處于不同象限,說明飲食結(jié)構(gòu)能顯著改變糞便菌群結(jié)構(gòu),但靈芝提取物能有效改善高脂誘導(dǎo)糞便菌群結(jié)構(gòu),使其向空白組菌群結(jié)構(gòu)發(fā)展。

由圖3C和3D可知,靈芝提取物能改善高脂飲食引起糞便菌群結(jié)構(gòu)的變化。與模型組相比,服用靈芝提取物能有效改善菌群結(jié)構(gòu),其中糞便中囊桿菌屬屬(Asaccharobacter)、梭菌屬(ClostridiumXIVb)、瘤胃球菌(Ruminococcus2)和糞球菌屬(Coprococcus)的豐富度均有減少,而乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、薩特菌屬(Sutterella)、另枝菌屬(Alistipes)、帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)和巴氏桿菌屬(Barnesiella)的豐富度均有增加。然而,服用靈芝提取物8周時(shí),糞便中考拉桿菌屬(Phascolsrctobacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、薩特菌屬(Sutterella)、脫硫化弧菌屬(Desulfovibrio)的豐富度均有升高;而厭氧棍狀菌屬(Anaerotruncus)、多爾氏菌屬(Dorea)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)的豐富度均有降低。

圖3 靈芝提取物對高脂飲食大鼠相關(guān)mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of GLE on gut microbiota composition in high-fat diet fed rats注:NFD_M、HFD_M和GLE_M分別表示第4周空白組、模型組和干預(yù)組, NFD_F、HFD_F和GLE_F分別表示第8周空白組、模型組和干預(yù)組。

有研究表明:鏈球菌屬(Streptococcus)的減少可有效預(yù)防和治療炎癥,并可控制機(jī)體肥胖[22];帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)豐富度與飲食有關(guān),拉普氏菌屬(Paraprevotella)豐富度越高，機(jī)體患病概率越高[23]。靈芝提取物可有效增加糞便中考拉桿菌屬(Phascolsrctobacterium)、薩特菌屬(Sutterella)和糞球菌屬(Coprococcus)豐富度,考拉桿菌屬、薩特菌屬和糞球菌屬是短鏈脂肪酸的主要生產(chǎn)微生物,其中丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞營養(yǎng)的主要來源[24-25],此外短鏈脂肪酸還具有抗炎和調(diào)節(jié)腸道免疫[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靈芝提取物能有效改善糞便菌群結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

靈芝55%醇提物能有效降低血清和肝臟中TG、TC和LDL-C含量,同時(shí)提高肝臟中HDL-C含量。用靈芝55%醇提物干預(yù)大鼠的高脂膳食,可有效降低肝臟中mRNA(SREBP-1C)水平,并提高PPARα水平。此外,靈芝55%醇提物顯著提高糞便中考拉桿菌屬(Phascolsrctobacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、薩特菌屬(Sutterella)和脫硫化弧菌屬(Desulfovibrio)的豐富度;并顯著降低厭氧棍狀菌屬(Anaerotruncus)、多爾氏菌屬(Dorea)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)的豐富度。研究結(jié)果為預(yù)防脂質(zhì)代謝紊亂和腸道菌群失調(diào)提供可靠的理論依據(jù)。