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(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院(華西第四醫(yī)院),四川成都 610041)

氧化應(yīng)激是指在體內(nèi)外有害因素刺激下,體內(nèi)自由基增加或機(jī)體抗氧化保護(hù)能力減弱,導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[1]。在此狀態(tài)下,過多積累的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)會(huì)造成核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子的損傷,進(jìn)而可能導(dǎo)致心血管疾病、阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏癥(Parkinson’s disease,PD)等慢性退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展[2]?？寡趸瘎┛赏ㄟ^中和自由基、清除氧化劑或防止氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿鼜?qiáng)的化合物,減緩或抑制細(xì)胞損傷,達(dá)到抗氧化的目的[3]。因此,研究有害因素引起氧化應(yīng)激的機(jī)制,評(píng)價(jià)并篩選有效的抗氧化劑,為抗氧化功能性食品的研發(fā)提供方向,對(duì)維護(hù)機(jī)體健康和預(yù)防控制疾病有重要意義。

目前,研究氧化應(yīng)激和抗氧化的方法主要包括化學(xué)法、動(dòng)物模型法和細(xì)胞模型法?；瘜W(xué)法雖然快速,但僅用單一的化學(xué)反應(yīng)無法反映體內(nèi)復(fù)雜的生理過程和作用機(jī)理。動(dòng)物模型法能真實(shí)模擬體內(nèi)環(huán)境,但卻存在周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。細(xì)胞模型法是以應(yīng)激源處理細(xì)胞,破壞細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原狀態(tài),通過產(chǎn)生能損傷DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)成分的物質(zhì),發(fā)揮毒性作用,模擬機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)[4],因此可有效反映有害物質(zhì)、抗氧化劑在細(xì)胞內(nèi)的吸收、代謝和利用情況,準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)環(huán)境,還可根據(jù)研究目的挑選最佳的細(xì)胞株建立模型,既可研究體內(nèi)外有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的氧化損傷效果和機(jī)制,也可有效評(píng)價(jià)或篩選抗氧化劑。然而,目前總結(jié)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型方法的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此,本文從細(xì)胞株的挑選、應(yīng)激源的選擇、模型判斷指標(biāo)等方面,對(duì)建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的方法進(jìn)行綜述,并從化學(xué)、物理和生物等方面對(duì)應(yīng)激源進(jìn)行了分類總結(jié),旨在為后續(xù)的有害物質(zhì)氧化應(yīng)激損傷評(píng)價(jià)、抗氧化劑篩選等研究提供參考。

1 氧化應(yīng)激細(xì)胞株的選擇

選擇合適的細(xì)胞是成功構(gòu)建細(xì)胞模型的關(guān)鍵,細(xì)胞本身的性能特點(diǎn)和生長(zhǎng)狀態(tài)都是評(píng)價(jià)抗氧化活性的影響因素,且細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的反應(yīng)程度會(huì)受到成分、暴露劑量和時(shí)間等多方面的影響。故需根據(jù)待評(píng)價(jià)的有害物質(zhì)或抗氧化劑的作用靶點(diǎn)和機(jī)制來選擇適宜的細(xì)胞株,才能建立可準(zhǔn)確反映作用效果的細(xì)胞模型。

本文從機(jī)體不同的功能系統(tǒng),對(duì)當(dāng)前研究中常使用的細(xì)胞株進(jìn)行總結(jié),見表1。根據(jù)研究目的的不同,可選擇目的器官或系統(tǒng)相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞株構(gòu)建模型,以達(dá)到最佳的建模效果。少數(shù)細(xì)胞株所具有的特殊生理特性,使得其可應(yīng)用于與其來源系統(tǒng)不同的其他方向。PC12細(xì)胞株雖來自鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤,但由于其可分化為具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞,常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究[5-6];來源于人胚胎腎細(xì)胞的HEK293易于生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染,不僅能評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激對(duì)腎臟造成的損傷[9],更廣泛用于通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建可表達(dá)外源基因的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型[10]。然而,對(duì)于絕大多數(shù)細(xì)胞株來說,仍保留其來源系統(tǒng)正常細(xì)胞的特征,因此普遍應(yīng)用于相應(yīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激研究。例如,炎癥、過敏反應(yīng)等免疫系統(tǒng)相關(guān)研究可采用免疫細(xì)胞來源的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系或大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系(RBL-2H3)建模[11-12];而骨質(zhì)疏松細(xì)胞模型的構(gòu)建,則選擇具有成骨細(xì)胞特點(diǎn)的人成骨肉瘤MG63細(xì)胞株和小鼠成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1[13-14]。

表1 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型常用細(xì)胞株及其細(xì)胞模型的應(yīng)用Table 1 Frequently-used cell lines and applications of cellular oxidative stress model

需要注意的是,細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境與其在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境存在差異,不同實(shí)驗(yàn)室間的研究結(jié)果也不盡相同,因此建立標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞模型體外培養(yǎng)體系,才能提高不同研究結(jié)果間的可比性。

2 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型應(yīng)激源的選擇

應(yīng)激源的選擇需考慮研究目的,研究某種物質(zhì)的氧化損傷效果,則選擇該物質(zhì)作為構(gòu)建細(xì)胞模型的應(yīng)激源;若要評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性,則應(yīng)根據(jù)該抗氧化劑的作用靶點(diǎn)和機(jī)制選擇應(yīng)激源,或直接選擇常用的應(yīng)激方法。本文對(duì)當(dāng)前研究中使用的應(yīng)激源進(jìn)行總結(jié),并分為以下幾類。

2.1 化學(xué)類應(yīng)激源

化學(xué)類應(yīng)激源種類較多,其中過氧化氫(H2O2)最為常見,它作為一種ROS,能抑制細(xì)胞增殖,造成細(xì)胞內(nèi)大分子的氧化損傷,最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡和突變等嚴(yán)重后果。因此,H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型普遍用于探究自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷機(jī)制及抗氧化劑對(duì)氧化損傷的保護(hù)和修復(fù)機(jī)制[22]。

部分具有神經(jīng)毒性的化學(xué)物質(zhì),可應(yīng)用于神經(jīng)性疾病的研究。1-甲基-4-苯基吡離子(MPP+)作為神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,可抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ并引起ROS的過量產(chǎn)生,從而引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,故常用于建立PD細(xì)胞模型[23]。6-羥基多巴胺(6-OHDA)也是一種神經(jīng)毒素,它能選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元,一旦進(jìn)入神經(jīng)元,6-OHDA積累并經(jīng)過非酶的自動(dòng)氧化,促進(jìn)ROS的形成[24],因而Liu等[25]以6-OHDA構(gòu)建PD細(xì)胞模型,評(píng)價(jià)大蒜素是否能通過抑制氧化應(yīng)激和線粒體功能紊亂,對(duì)PD相關(guān)神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。此外,谷氨酸鹽是一種興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì),利用谷氨酸鹽興奮性中毒的原理,可直接用谷氨酸鹽誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡,構(gòu)建由缺血引起神經(jīng)損傷的細(xì)胞模型,探索大腦局部缺血的機(jī)制[26]。

一些化學(xué)物質(zhì)可以作為自由基引發(fā)劑,在自由基反應(yīng)中能產(chǎn)生自由基,因此也可作為應(yīng)激源。2,2-偶氮二(2-甲基丙基脒)二鹽酸鹽(AAPH)是一種小分子偶氮引發(fā)劑,可誘導(dǎo)過氧自由基的生成,通過細(xì)胞氧化損傷導(dǎo)致機(jī)體各種病理改變,因此AAPH作為自由基產(chǎn)生源,常用于紅細(xì)胞、血漿和全血等的抗氧化活性研究[27]。叔丁基過氧化氫(t-BHP)也是一種常用的自由基反應(yīng)引發(fā)劑,可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞和組織氧化應(yīng)激機(jī)制的助氧化劑,周曦等[28]以t-BHP建立HUVEC模型,研究白藜蘆醇對(duì)HUVEC氧化應(yīng)激損傷的抑制作用和機(jī)制,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過活化SIRT1抑制UCP2表達(dá),削弱t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成,從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

此外,藥物也可用于氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建,例如,阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一種有效的化療藥物,但會(huì)引起心動(dòng)過速、心律不齊、低血壓等各種心臟毒性,氧化應(yīng)激是DOX引發(fā)心肌損傷的關(guān)鍵因素,這是由于DOX能產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基,從而引發(fā)線粒體功能障礙和細(xì)胞損傷。故Zhao等[29]以DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷對(duì)DOX引起的心臟毒性有抑制作用,并闡明薯蕷皂苷是通過調(diào)節(jié)miR-140-5p介導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激,來減輕DOX引起的心臟毒性。

總而言之,化學(xué)類應(yīng)激源種類繁多,不僅有外源性氧化劑和神經(jīng)毒素,還包括對(duì)機(jī)體有毒性作用的藥物,選擇多,易獲取,在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型構(gòu)建中應(yīng)用廣泛。

2.2 物理類應(yīng)激源

物理類應(yīng)激源主要包括紫外照射、輻照和空氣顆粒物等,其來源于外部環(huán)境,并會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化損傷。紫外線照射是導(dǎo)致皮膚光老化的主要原因,楊清建等[30]采用UVB體外照射模擬皮膚成纖維細(xì)胞的光老化,研究肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)抗ROS的作用。隨著移動(dòng)通信系統(tǒng)的發(fā)展和手機(jī)的廣泛使用,人們?cè)絹碓疥P(guān)注手機(jī)輻射的潛在危害,Hou等[31]將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系間歇暴露于1800 MHz的GSM-talk模式的電磁輻射中,以評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的氧化損傷作用。PM2.5誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是其發(fā)揮毒性作用的重要分子機(jī)制,故Deng等[32]以PM2.5建立細(xì)胞模型,探究細(xì)胞內(nèi)PM2.5相關(guān)的抗氧化防御機(jī)制。

另外,石棉、除草劑等建筑業(yè)或農(nóng)業(yè)常用材料,廣泛存在于外界環(huán)境并危害人體健康,為研究相關(guān)藥物對(duì)它們所引起氧化損傷的抑制作用,可直接用石棉或除草劑處理細(xì)胞,構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型[33-34]。

2.3 生物類應(yīng)激源

生物類應(yīng)激源主要包括基因工程技術(shù)和體內(nèi)代謝產(chǎn)物?；蚬こ谭椒ǔＲ娪贏D相關(guān)研究,AD的病理學(xué)標(biāo)志是細(xì)胞外淀粉樣蛋白斑,它的形成是由于淀粉樣前體蛋白(APP)基因突變,使APP更易被β-分泌酶和γ-分泌酶水解,導(dǎo)致分解產(chǎn)物淀粉樣蛋白40(Aβ40)和Aβ42的非正常積累與沉積[35]。故采用病毒轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),將合成的APP變異基因(APPswe)轉(zhuǎn)染到SH-SY-5Y細(xì)胞上,構(gòu)建APP蛋白過表達(dá)的AD細(xì)胞模型[36],也可直接將攜帶瑞典突變APP基因的Hek293細(xì)胞(Hek293-APPswe)作為AD的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型[37]。

體內(nèi)的某些代謝物會(huì)對(duì)細(xì)胞、組織等造成損傷,因此也常將這些代謝物用作應(yīng)激源構(gòu)建體外細(xì)胞模型。例如,曹慧敏等[38]以氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)建立細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能上調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激模型的自噬,保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷;AD細(xì)胞模型的構(gòu)建除采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)外,還可直接用Aβ1-40或Aβ1-42處理PC12等細(xì)胞以構(gòu)建細(xì)胞模型,進(jìn)而研究抗氧化劑對(duì)AD的抑制效果[39]。

人為的選擇與疾病相關(guān)的應(yīng)激源,體外模擬氧化應(yīng)激,能反映抗氧化劑在機(jī)體病理狀態(tài)下的作用機(jī)制。但鮮有研究對(duì)比不同應(yīng)激源引起的細(xì)胞氧化損傷的差異,因此在今后的研究中,可使用多種應(yīng)激源對(duì)細(xì)胞造成不同程度的氧化損傷,從而進(jìn)一步比較抗氧化劑對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

3 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的模型判斷指標(biāo)

要成功建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型,在應(yīng)激源處理細(xì)胞后,還需檢測(cè)細(xì)胞損傷情況,評(píng)價(jià)應(yīng)激源是否引起細(xì)胞的氧化損傷,及損傷程度的大小,以選擇最佳的造模條件。常用的檢測(cè)指標(biāo)主要通過細(xì)胞存活率、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、脂質(zhì)過氧化物和抗氧化酶類等四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。

MTT法和CCK-8法是常用的評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率的方法,CCK-8法測(cè)定的準(zhǔn)確度和精確度均高于MTT法,且該法操作簡(jiǎn)便快速,對(duì)環(huán)境的危害小,因此,在構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型時(shí),應(yīng)推廣以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率[40]。細(xì)胞內(nèi)總ROS水平多采用二氯熒光素二乙酸酯探針(DCFDA)法測(cè)定,它是評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化應(yīng)激程度最直接的指標(biāo)[41]。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可通過攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸,從而造成細(xì)胞損傷,因此可直接反映氧化損傷,在細(xì)胞模型中常用的指標(biāo)是丙二醛(MDA),采用硫代巴比妥酸(TBARS)法進(jìn)行檢測(cè)[42]。另外,抗氧化相關(guān)酶類能間接反映細(xì)胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng),例如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等,它們能將自由基轉(zhuǎn)化為非毒性形式,是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)重要的組成部分,影響著體內(nèi)氧化和抗氧化作用之間的動(dòng)態(tài)平衡[43],這些酶類數(shù)量的增減可反映細(xì)胞內(nèi)的氧化狀態(tài),故常將抗氧化酶類的活性作為構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型時(shí)的檢測(cè)指標(biāo)。

細(xì)胞存活率和細(xì)胞內(nèi)ROS水平是篩選造模條件的關(guān)鍵指標(biāo),最佳的造模條件需滿足在該應(yīng)激源處理濃度和誘導(dǎo)時(shí)間下,既能使細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著增加,又能最大限度地減少對(duì)細(xì)胞的傷害[44]。在實(shí)際研究中,通常會(huì)設(shè)立多個(gè)應(yīng)激源濃度或強(qiáng)度、不同的作用時(shí)間,綜合考慮不同條件下各指標(biāo)的差異來選擇最佳造模條件。若在某一條件下,模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平相比明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時(shí)模型組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比沒有顯著降低,另外若模型組的MDA、SOD、GSH-Px等發(fā)生顯著變化,說明應(yīng)激源已引起氧化應(yīng)激,且細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和酶系均發(fā)生顯著改變,即可認(rèn)為造模成功。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

氧化應(yīng)激細(xì)胞模型廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)體內(nèi)外有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞、組織的氧化損傷作用,并用于篩選有效的抗氧化劑。相比于動(dòng)物模型法和化學(xué)實(shí)驗(yàn)法,細(xì)胞模型法有快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì),還能模擬體內(nèi)環(huán)境。此外,細(xì)胞模型法的評(píng)價(jià)機(jī)制靈活,可供選擇的細(xì)胞株和應(yīng)激源種類多,基因工程技術(shù)也可用于細(xì)胞模型的構(gòu)建,研究人員可根據(jù)研究基礎(chǔ)和目的,選擇適宜的細(xì)胞株和應(yīng)激源建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型,從而對(duì)有害物質(zhì)的氧化損傷作用、抗氧化劑的抗氧化活性作出更加準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。然而,細(xì)胞模型法也存在不足之處,比如一些通過膳食補(bǔ)充的抗氧化劑是成分復(fù)雜的混合物,須經(jīng)消化道消化后才能被機(jī)體吸收并到達(dá)靶細(xì)胞發(fā)揮作用,這是一個(gè)復(fù)雜的過程,機(jī)體內(nèi)不同細(xì)胞間會(huì)相互影響,因此針對(duì)單一靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與抗氧化劑進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮作用的實(shí)際情況有較大差別。

由于氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的多種多樣,在研究中,要構(gòu)建最佳的細(xì)胞模型存在一定的難度;且目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)化的抗氧化細(xì)胞模型評(píng)價(jià)體系和指標(biāo)檢測(cè)手段,各實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果難以進(jìn)行統(tǒng)一比較。因此,研究并建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的、完整的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型評(píng)價(jià)體系是未來發(fā)展方向,同時(shí),還應(yīng)通過不斷優(yōu)化和改進(jìn),使未來的細(xì)胞模型評(píng)價(jià)體系更加經(jīng)濟(jì)高效、安全低毒。