汪建紅

（1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641110；2.四川省高等學(xué)校“果類廢棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江641110）

荸薺是一種在中國(guó)有三千年種植歷史的水果，在我國(guó)有較大的種植面積，達(dá)到5 萬(wàn)hm2以上，年產(chǎn)量達(dá)百萬(wàn)噸以上[1-2]。荸薺味甜多汁，深受人們喜愛(ài)，有“地下雪梨”的美稱[1]。常被作為垃圾拋棄的荸薺皮富含多種有效成分，其中就包括色素。荸薺皮色素作為一種天然色素，安全無(wú)毒副作用，甚至具有一定的療效和保健功能，研究荸薺皮中色素的提取意義重大[3-8]。

色素常用的提取方法有有機(jī)溶劑浸提法、堿法、微波法、超聲波法等。有機(jī)溶劑浸提法[9-13]浸提時(shí)間長(zhǎng)、效率低，分離效果不好。堿法[5]操作簡(jiǎn)便，但會(huì)產(chǎn)生大量腐蝕性較強(qiáng)的廢液，對(duì)環(huán)境帶來(lái)了較大的負(fù)面影響。微波法[13-17]和超聲波法[13，18-20]高效省時(shí)，但微波和超聲波對(duì)人體會(huì)帶來(lái)較大的負(fù)面影響。酶法[21-25]利用破壁作用來(lái)降低傳質(zhì)阻力幫助提取，操作簡(jiǎn)便，且效率較高，也尚未見(jiàn)在荸薺皮色素提取中應(yīng)用的記載。常見(jiàn)的酶中木瓜蛋白酶活力值高、易溶解、后處理容易，而且還可催化蛋白質(zhì)水解，減少蛋白質(zhì)對(duì)提取的影響，因此該試驗(yàn)采用木瓜蛋白酶的方法提取荸薺皮色素，并優(yōu)化提取工藝條件，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑及材料

荸薺：四川內(nèi)江農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；木瓜蛋白酶（生物試劑，活力值≥80 萬(wàn)U/g）：上海源葉生物科技有限公司；乙酸鈉、乙酸、無(wú)水乙醇（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T-6 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；7230G 型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州英峪予華儀器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2204A 型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；DFT-100 型手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；SHB-B95 型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；CS101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：重慶試驗(yàn)設(shè)備廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

稱取1.00 g 荸薺皮干粉加入到圓底燒瓶中，再加入20 mL 利用pH值為5 的水溶液配制的體積濃度為30%的乙醇溶液，40 ℃下回流2 h，沸水浴滅酶，冷卻，離心取清液，過(guò)濾，將濾液在50 mL 容量瓶中，用乙醇定容。從容量瓶中取出液體，在300 nm～600 nm 范圍內(nèi)利用紫外分光光度計(jì)掃描，發(fā)現(xiàn)在430 nm 處有一強(qiáng)吸收峰，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[26]相符，因此選擇430 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 荸薺皮色素的提取和測(cè)定

稱取1.00 g 荸薺皮干粉加入到圓底燒瓶中，按照一定液料比加入利用pH值為5 的水溶液配制的一定體積濃度的乙醇溶液，在一定溫度下回流一定時(shí)間，沸水浴滅酶，冷卻，離心取清液，過(guò)濾，將濾液在50 mL 容量瓶中，用乙醇定容。

從50mL 容量瓶中取出2.00 mL 溶液，加入到25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋到10 mL。比色管中取出液體在430 nm 波長(zhǎng)位置，測(cè)定其吸光度值。由于比爾-朗伯定律[27]，吸光度與濃度之間存在良好的線性關(guān)系，所以本試驗(yàn)以吸光度值的大小反映荸薺皮色素提取的效果。

2.3 單因素試驗(yàn)

在荸薺皮質(zhì)量1.00 g 的條件下，利用單因素試驗(yàn)考查乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、酶用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）]、溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）和提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）的影響。

2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、酶用量、液料比、溫度和時(shí)間5 個(gè)因素，每個(gè)因素4 個(gè)水平，設(shè)計(jì)L16（45）正交表并安排試驗(yàn)，重復(fù)2.2 的操作。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 乙醇濃度對(duì)色素提取效果的影響

乙醇濃度對(duì)荸薺皮色素提取效果的影響如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)色素提取效果的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction effect of pigment

從圖1可看到隨著乙醇濃度的增加，提取液的吸光度越來(lái)越大；當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到70%后，繼續(xù)增大乙醇濃度，提取液吸光度值沒(méi)出現(xiàn)明顯增大。這是由于荸薺皮色素在乙醇中溶解度較大，乙醇濃度越大，則能溶解進(jìn)入溶液的荸薺皮色素越多，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，荸薺皮色素已經(jīng)基本完全進(jìn)入溶液中，而且乙醇濃度的增加也會(huì)導(dǎo)致一些難溶于乙醇的樹(shù)脂狀雜質(zhì)量的增加，同時(shí)木瓜蛋白酶在乙醇中溶解度較小，乙醇濃度太大時(shí)可能會(huì)使木瓜蛋白酶不能均勻分散甚至以固體形式析出，導(dǎo)致活力值得不到充分發(fā)揮，使荸薺皮色素的提取受到影響。因此，綜合考慮得率和節(jié)約資源，選擇乙醇濃度為70%。

3.1.2 酶用量對(duì)色素提取效果的影響

酶用量對(duì)荸薺皮色素提取效果的影響如圖2所示。

從圖2可看到，隨著木瓜蛋白酶用量的增加，從吸光度變化可看到荸薺皮色素得率逐漸增加；當(dāng)酶用量達(dá)到0.5%后，隨著酶用量的繼續(xù)增加提取液吸光度沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化。這是由于木瓜蛋白酶具有破壁作用，酶用量越大，則破壁能力越強(qiáng)，越有利于荸薺皮色素從荸薺皮組織解吸進(jìn)入溶液中，但當(dāng)酶用量達(dá)到0.5%時(shí)，其破壁能力幾乎已發(fā)揮到極致。因此，考慮到節(jié)約資源，選擇酶用量為0.5%。

圖2 酶用量對(duì)色素提取效果的影響Fig.2 Influence of enzymatic dosage on extraction effect of pigment

3.1.3 液料比對(duì)色素提取效果的影響

液料比對(duì)荸薺皮色素得率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)色素提取效果的影響Fig.3 Influence of liquid-solid ratio on extraction effect of pigment

從圖3可看到，隨著溶劑用量的增加，吸光度先逐漸增加，后逐漸降低，當(dāng)液料比為35∶1（mL/g）時(shí)達(dá)最大值。這是由于溶劑越多，能溶解的荸薺皮色素越多，但溶解帶出的脂溶性雜質(zhì)也越多，導(dǎo)致傳質(zhì)阻力增大使荸薺皮色素的析出受到抑制。因此，選擇液料比為35∶1（mL/g）。

3.1.4 溫度對(duì)色素提取效果的影響

提取溫度對(duì)荸薺皮色素提取效果的影響如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)色素提取效果的影響Fig.4 Influence of temperature on extraction effect of pigment

從圖4可看到在30 ℃～50 ℃溫度范圍內(nèi)，隨提取溫度升高，吸光度逐漸增大，當(dāng)溫度為50 ℃達(dá)最大值；此后在50 ℃～80 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，吸光度逐漸下降。這是由于溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)越活躍，就會(huì)有更多的荸薺皮色素進(jìn)入并溶于溶液中，但溫度過(guò)高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)過(guò)快，會(huì)導(dǎo)致荸薺皮色素從荸薺皮組織解吸進(jìn)入溶液中的通道受阻，也會(huì)導(dǎo)致已進(jìn)入溶液的部分荸薺皮色素氧化變質(zhì)。因此，選擇提取溫度為50 ℃。

3.1.5 時(shí)間對(duì)色素提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)荸薺皮色素提取效果的影響如圖5所示。

圖5 時(shí)間對(duì)色素提取效果的影響Fig.5 Influence of time on extraction effect of pigment

從圖5可看到在1 h～4 h 范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增大，作為反映荸薺皮色素提取效果指標(biāo)的吸光度逐漸增加；當(dāng)達(dá)到4 h 時(shí)，達(dá)最大值；此后隨時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這是由于時(shí)間越長(zhǎng)，則解吸進(jìn)入溶液中的荸薺皮色素越多，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致浸出的部分色素在酶作用下分解變質(zhì)。因此選擇提取時(shí)間為4 h。

3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以乙醇濃度、酶用量、液料比、溫度和時(shí)間為因素的L16（45）正交表的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)結(jié)果及極差分析結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 L16（45）正交試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 L16（45）orthogonal experimental design and results

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of the orthogonal experiment results

從表1可看到，最佳水平組合為A4B4C3D3E4，即乙醇濃度90%，酶用量0.7%，液料比35∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間5 h。

從表2 的方差分析可知在所選擇的正交試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)，因素A、B 即乙醇濃度、酶用量的影響，均達(dá)到非常顯著的水平（p＜0.01），因素C、E 即液料比和提取時(shí)間的影響達(dá)到了顯著的水平（p＜0.05），因素D 即提取溫度的影響不顯著。而F 值結(jié)果表明，各因素影響的主次順序?yàn)椋篈（乙醇濃度）＞B（酶用量）＞E（提取時(shí)間）＞C（液料比）＞D（提取溫度）。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果作了3 次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，所得吸光度值分別為0.888、0.890、0.910，平均值0.896，高于正交試驗(yàn)表中的值，說(shuō)明了正交試驗(yàn)結(jié)果的正確性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用木瓜蛋白酶提取荸薺皮色素的最佳工藝條件為：乙醇濃度90 %，酶用量0.7 %，液料比35∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間5 h。最佳條件下所測(cè)得的荸薺皮色素提取液的吸光度值為0.896，高于相同條件下不使用酶時(shí)的測(cè)得值0.769。該結(jié)論為荸薺皮色素的開(kāi)發(fā)利用提供了基本參考依據(jù)。