張錫霞，李永貴，王 晶

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

魚(yú)腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，用于肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢熱淋、癰腫瘡毒[1]。其功效主要與其抗病原微生物、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用相關(guān)[2]。魚(yú)腥草的有效成分是其揮發(fā)性物質(zhì)，通過(guò)質(zhì)譜學(xué)確定其結(jié)構(gòu)，其主要有效成分為癸酰乙醛（魚(yú)腥草素）和2-十一烷酮(甲基正壬酮）[3]。癸酰乙醛具有抗病原微生物的活性，但由于化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易聚合，于是通過(guò)人工合成制得了癸酰乙醛的亞硫酸氫鈉加成物即魚(yú)腥草素鈉[4]。

魚(yú)腥草素鈉栓為乳白色或微黃色的卵形栓劑，為抗感染類藥，消炎效果好，副作用小，用于治療子宮頸糜爛有特效[5]。西安瀾泰藥業(yè)有限公司于2006年率先獲得了魚(yú)腥草素鈉栓的生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)。

因魚(yú)腥草素鈉含有化學(xué)性質(zhì)活潑的醛酮結(jié)構(gòu)，易發(fā)生聚合、氧化等多種降解反應(yīng)。通過(guò)參考文獻(xiàn)，根據(jù)降解動(dòng)力學(xué)及縮合反應(yīng)機(jī)制，魚(yú)腥草素中含有二分子羥醛縮合產(chǎn)物（二聚物），但二聚物為縮合過(guò)程中的中間過(guò)渡狀態(tài)，縮合產(chǎn)物以穩(wěn)定的魚(yú)腥草素鈉三聚物（三聚物）形式存在[6-7]。由于魚(yú)腥草素鈉栓國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-（HD-1078）-2002中無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)[8]，故將三聚物作為魚(yú)腥草素鈉栓有關(guān)物質(zhì)考察對(duì)象，參考縮合反應(yīng)機(jī)制，制備三聚物；同時(shí)通過(guò)氫譜、碳譜、質(zhì)譜，確定其結(jié)構(gòu)，建立了三聚物檢查的HPLC法，進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證[9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀帶有LC-20AT型泵、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10AS vp型柱溫箱、LC SoLution液相色譜數(shù)據(jù)工作站（日本島津公司）；BT125D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；pHSJ-3F型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）；艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都艾柯）。

1.2 試藥

魚(yú)腥草素鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100247-199601）；魚(yú)腥草素鈉栓（自制，規(guī)格：20 mg，批號(hào)120301，120302，120303）；三聚物對(duì)照品（自制，批號(hào)：YXCSJW-1，純度：98.19%）；甲醇（山東禹王）；超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 三聚物對(duì)照品溶液的制備 精密稱取三聚物對(duì)照品約10 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，超聲，使完全溶解，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取1 ml置入100 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取魚(yú)腥草素鈉栓10粒，切成小片，精密稱取適量（約相當(dāng)于魚(yú)腥草素鈉0.02 g），置入100 ml量瓶，加甲醇少許，將量瓶置熱水浴中，輕輕振搖使完全溶解，取出，放冷至室溫，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。將量瓶置冰水浴中冷卻20 min，以0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，續(xù)濾液放至室溫，精密量取1 ml，置入10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取魚(yú)腥草素鈉對(duì)照品約20 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，超聲，使完全溶解，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為魚(yú)腥草素鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取2.1.1項(xiàng)三聚物對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密移取此溶液1 ml及魚(yú)腥草素鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置入同一10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用YMC-Pack ODS A（4.6 mm×150 mm，5μm）色譜柱；以甲醇：水（99：1）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，柱溫35 ℃，流速1.4 ml/min，進(jìn)樣體積為20 μl。系統(tǒng)適用性溶液的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液的液相色譜圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 耐用性試驗(yàn)[10]取系統(tǒng)適用性溶液，通過(guò)改變色譜條件中色譜柱、流速、流動(dòng)相比例、柱溫等因素，考察耐用性。在微小變動(dòng)因素條件下，主峰與三聚物之間分離度良好，結(jié)果表明，該色譜條件耐用性良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 耐用性試驗(yàn)結(jié)果表

2.3.2 檢測(cè)限與定量限測(cè)定 精密稱取三聚物對(duì)照品適量，加甲醇溶解并用流動(dòng)相定量稀釋，制成不同梯度濃度的系列溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定。測(cè)得魚(yú)腥草素鈉三聚物的檢測(cè)限為2.45 ng（S/N≈3）；定量限為8.16 ng（S/N≈10）。

2.3.3 破壞性試驗(yàn) 分別取魚(yú)腥草素鈉栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，將量瓶置熱水浴中，輕輕振搖使完全溶解，分別加1 mol/L鹽酸溶液1 ml，2 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 ml，90 ℃水浴加熱1 h，冷卻，分別以1 mol/L氫氧化鈉溶液、2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，作為制劑酸、堿破壞儲(chǔ)備液。取魚(yú)腥草素鈉栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，90 ℃水浴加熱1 h，冷卻，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，作為制劑高溫破壞儲(chǔ)備液。取魚(yú)腥草素鈉栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，加入30%雙氧水溶液1 ml，置90 ℃水浴放置5 min，冷卻，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，作為制劑氧化破壞儲(chǔ)備液。精密移取各破壞儲(chǔ)備液1 ml，置入10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，作為制劑破壞溶液。同法破壞空白基質(zhì)栓，按2.1項(xiàng)同法制備破壞前供試品、破壞前空白基質(zhì)栓溶液及三聚物對(duì)照品溶液，精密量取制劑破壞溶液、制劑破壞前供試品溶液、三聚物對(duì)照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計(jì)算三聚物含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，制劑的高溫、酸、堿、氧化破壞樣品中各降解峰與主峰分離度良好，空白基質(zhì)對(duì)三聚物無(wú)干擾，表明本色譜條件適用于魚(yú)腥草素鈉栓三聚物的檢查。本方法具有專屬性。

表2 破壞性試驗(yàn)結(jié)果表

2.3.4 線性與范圍 精密稱取魚(yú)腥草素鈉三聚物約10 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，超聲使其溶解，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密移取5 ml，置50 ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗(yàn)儲(chǔ)備液。精密移取儲(chǔ)備液1 ml置100 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密移取1 ml置入10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗(yàn)溶液1，分別精密移取線性試驗(yàn)儲(chǔ)備液1，2，4，5，6 ml置50 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液2，3，4，5，6。精密移取上述溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=66 421X-309.41，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。表明三聚物在0.009 43～1.131 μg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 取空白基質(zhì)栓10粒，切成小片，精密稱取適量（約相當(dāng)于魚(yú)腥草素鈉栓一粒的重量），置入100 ml量瓶，加甲醇少許，將量瓶置熱水浴中，輕輕振搖使其完全溶解，取出，放冷至室溫，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。作為空白基質(zhì)栓儲(chǔ)備液。精密稱取魚(yú)腥草素鈉三聚物2，5，10 mg各3份，分別置入100 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 ml，分別置入10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取空白基質(zhì)栓儲(chǔ)備液續(xù)濾液及對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置入同一10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按2.1.1項(xiàng)制備三聚物對(duì)照品溶液。

精密量取三聚物對(duì)照品溶液及各供試品溶液20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算，即得，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密量取三聚物對(duì)照品溶液20 μl注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及峰面積。峰面積RSD為1.05%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品（批號(hào)120301），精密稱定，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行配制6分，分別取20 μl注入液相色譜儀，考察方法的重復(fù)性，計(jì)算RSD為1.01%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取三聚物對(duì)照品溶液20 μl，分別于0，2，4，6，8 h注入液相色譜儀。記錄色譜圖及峰面積，峰面積RSD為0.80%。表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 三聚物的測(cè)定

取魚(yú)腥草素鈉栓三批（批號(hào)：120301，120302，120303），按2.1項(xiàng)供試品溶液及三聚物對(duì)照品溶液，精密量取供試品溶液、三聚物對(duì)照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有與三聚物對(duì)照品溶液色譜圖中保留時(shí)間一致的峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。結(jié)果分別是0.04%，0.04%，0.04%。

4 討論

4.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取魚(yú)腥草素鈉三聚物對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇成每1 ml中含4.12 μg的溶液；取魚(yú)腥草素鈉栓2粒，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中含魚(yú)腥草素鈉0.01 mg溶液，以0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用；取空白基質(zhì)適量，精密稱定，同法配制。照分光光度法（中國(guó)藥典2015年版四部附錄0401）在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)以上各溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，魚(yú)腥草素鈉三聚物對(duì)照品溶液以及魚(yú)腥草素鈉栓溶液均在228 nm處有最大吸收?？瞻谆|(zhì)無(wú)干擾，因此，選228 nm作為魚(yú)腥草素鈉三聚物檢查的波長(zhǎng)。

4.2 流動(dòng)相比例選擇

當(dāng)用純甲醇做流動(dòng)相時(shí)，基線不平，干擾三聚物測(cè)定，當(dāng)用98%甲醇做流動(dòng)相時(shí)，魚(yú)腥草素鈉出峰時(shí)間較晚，故選擇99%甲醇做魚(yú)腥草素鈉栓中三聚物測(cè)定的流動(dòng)相。

4.3 方法評(píng)價(jià)

本方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，儀器重復(fù)性良好，可用于魚(yú)腥草素鈉栓三聚物檢查。