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        基于低場核磁共振技術(shù)的不同品牌黃明膠的快速鑒別初探

        2019-04-12 05:35:08程素盼姜姣姣趙恒強(qiáng)郭興峰張渝潔耿巖玲
        食品與藥品 2019年2期
        關(guān)鍵詞:貢獻(xiàn)率藥材反演

        程素盼,姜姣姣,趙恒強(qiáng),郭興峰,張渝潔,崔 莉,王 曉,耿巖玲*

        (1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355;2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省分析測試中心,山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250014;3.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 聊城 252059;4.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 臨沂 276005)

        黃明膠(cattle-hide glue)作為養(yǎng)血止血良藥載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)》,是??苿?dòng)物黃牛的皮經(jīng)熬制并佐以黃酒、豆油等加工而成,性味甘平,主入肺、大腸經(jīng),具有滋陰潤燥、養(yǎng)血止血的功效,臨床上常用于治療體虛便秘、腎虛遺精、吐血、嘔血,胎漏、崩漏等癥[1-4]。近年,隨著消費(fèi)者健康養(yǎng)生意識(shí)的逐步提高,膠類藥材成為消費(fèi)者日常滋補(bǔ)的選擇之一,其中阿膠與黃明膠都是比較常見的滋補(bǔ)膠類藥材,既可作為藥品,又可作為普通食品[5-7]。目前市場上以阿膠為貴,阿膠的偽品較多且倍受重視,相較而言,黃明膠作為一味已上市的非處方藥報(bào)道很少[1],尚未實(shí)現(xiàn)不同品牌黃明膠的區(qū)分辨識(shí)[8],亟需一種簡便、快速、無損的鑒別不同品牌黃明膠的方法。

        目前,膠類藥材的鑒定技術(shù)主要有:液質(zhì)聯(lián)用檢測多肽片段[8],雙向凝膠電泳[9]及DNA鑒定技術(shù)[10]。膠類藥材被酶解后,經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)進(jìn)行多肽識(shí)別,需要大量的測試、對(duì)比及后期驗(yàn)證工作,若在此基礎(chǔ)上建立不同膠類藥材酶解的特異性肽段及質(zhì)譜信息庫,對(duì)于實(shí)現(xiàn)膠類藥材的專屬性鑒別有重要價(jià)值,但如何找到一個(gè)可切割出盡量多特征肽段的蛋白酶難度較大。雙向電泳與單獨(dú)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF-PAGE)相比,其分辨率更高,可直觀地找出具有差異性的蛋白點(diǎn),是目前較常見的蛋白質(zhì)分離技術(shù),但缺點(diǎn)是樣品中鹽、脂質(zhì)等對(duì)此法影響嚴(yán)重且重現(xiàn)性較差。DNA鑒定法對(duì)于含其他種源性成分的膠類藥材可進(jìn)行準(zhǔn)確判斷,但成本高。因此開發(fā)一種快速、有效且操作簡便的檢測方法,是十分有意義的。

        低場核磁共振(LF-NMR)是一種可靠的、信息豐富的非侵入性分析技術(shù),可探尋天然產(chǎn)物中小分子的質(zhì)子,因其快速、無損等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于對(duì)食品和藥物的質(zhì)量控制研究[11-18]。相比傳統(tǒng)的膠類鑒定手段,LF-NMR技術(shù)具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢[19-20]:(1)過程簡便,無需復(fù)雜的前處理;(2)安全性好;(3)檢測速度快;(4)無損:無需加入試劑、不浪費(fèi)樣品,特別適合價(jià)格昂貴樣品的真?zhèn)舞b別。本研究以不同廠家黃明膠為研究對(duì)象,結(jié)合主成分法(PCA)對(duì)所獲得的CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脈沖序列回波峰點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,為探索LF-NMR鑒別不同品牌黃明膠提供試驗(yàn)依據(jù)。

        1 儀器與材料

        NMI20-Analyst核磁共振分析儀(上海紐邁);飛利浦料理機(jī)HR2874/00(飛利浦電子公司);ME20型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)。5個(gè)不同廠家黃明膠樣品具體信息見表1。

        表1 黃明膠樣品來源

        2 方法

        2.1 樣品制備

        將表1中5個(gè)不同品牌黃明膠樣品分別經(jīng)料理機(jī)粉碎后,過40目篩,備用。

        2.2 樣品檢測

        取樣品粉末10 g,置入20 mm核磁管底部,于35 ℃下使用LF-NMR在CPMG脈沖序列下采集信號(hào),設(shè)置參數(shù)如表1,每類樣品設(shè)置8個(gè)平行樣品,每個(gè)樣品重復(fù)測定3次,求取平均值。

        表2 應(yīng)用脈沖序列參數(shù)

        2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

        采用Multi Exp Inv Analysis軟件對(duì)不同品牌黃明膠樣品CPMG回波峰點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行反演擬合,并使用SPSS 22.0軟件對(duì)反演后的T2弛豫時(shí)間、峰面積S2及峰面積所占比例P進(jìn)行主成分分析(PCA),采用Origin 8.5對(duì)結(jié)果進(jìn)行繪圖。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 不同品牌黃明膠的T2反演圖譜

        圖1顯示了5個(gè)不同品牌黃明膠的橫向弛豫時(shí)間圖譜,由圖1可見,5個(gè)不同品牌的黃明膠均包含3個(gè)峰:T21、T22和T23。5個(gè)品牌黃明膠進(jìn)行兩兩比較,弛豫時(shí)間T2和峰面積S2均明顯不同。LF-NMR結(jié)果見表3。由表3可見,任取2個(gè)不同品牌的黃明膠進(jìn)行對(duì)比,6個(gè)變量中至少有4個(gè)變量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表3 不同品牌黃明膠LF-NMR結(jié)果

        圖1 不同品牌黃明膠的橫向弛豫圖譜

        3.2 不同品牌黃明膠的PCA結(jié)果

        主成分分析(principal component analysis,PCA)是模式識(shí)別中較常用的多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法[21]。在不丟掉原來主要信息的前提下,從多個(gè)數(shù)值變量(指標(biāo))之間的相互關(guān)系入手,利用降維的思想,將原來的多個(gè)指標(biāo)組合成少數(shù)幾個(gè)互不相干的綜合指標(biāo),形成特征向量。利用降維后的特征向量作PCA散點(diǎn)圖,使數(shù)據(jù)可視化,進(jìn)而直觀地反映樣品之間的整體差異。

        選取反演后得到5個(gè)品牌黃明膠樣品信息的9個(gè)變量(T21、T22、T23峰起始時(shí)間、峰面積S21、S22、S23及相應(yīng)峰面積所占比例P)進(jìn)行PCA,根據(jù)PCA原理,主成分1為圖2中橫坐標(biāo),主成分2為縱坐標(biāo),其中包含了各主成分在PCA轉(zhuǎn)換中的貢獻(xiàn)率??傌暙I(xiàn)率大于70%~85%的方法即可使用[22-24],貢獻(xiàn)率越大,說明主成分可較好地反映原始變量信息。圖2為5個(gè)品牌黃明膠前兩個(gè)主成分PC1和PC2的得分圖,圖中每個(gè)樣品的整體特性用一個(gè)圈表征,其中8個(gè)小點(diǎn)代表此樣品的平行樣品。不同樣品類間品質(zhì)差異與樣品間隔距離成正比,距離越遠(yuǎn)樣品品質(zhì)差異越大[25]。

        圖2 不同品牌黃明膠的PCA得分圖

        根據(jù)表3不同品牌黃明膠之間差異性比較,將反演后得到的9個(gè)變量(T21、T22、T23峰起始時(shí)間、峰面積S21、S22、S23及相應(yīng)峰面積所占比例P)均進(jìn)行PCA。PC1和PC2得分累積貢獻(xiàn)率為97.38%,其中PC1的貢獻(xiàn)率為91.73%,即保留了91.73%的原始數(shù)據(jù)信息,PC2包含了5.65%的信息。由圖2可見,5種不同品牌的黃明膠分布距離較遠(yuǎn),雖在PC1軸上得不到準(zhǔn)確區(qū)分,但結(jié)合PC2軸后,均能兩兩區(qū)分開來,推測是由于不同品牌黃明膠生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)用水、所用輔料等存在一定的差異[25],導(dǎo)致LF-NMR結(jié)果存在明顯差異,在PCA得分圖上被很好地體現(xiàn)出來。

        4 結(jié)論

        LF-NMR作為一種現(xiàn)代化檢測分析技術(shù),在鑒別不同品牌膠類藥材中具有較大的應(yīng)用潛力,無需添加其他化學(xué)試劑和復(fù)雜前處理,樣品不受污染與破壞,制樣方便,耗時(shí)短,屬于一種非破壞快速檢測手段。結(jié)果表明,結(jié)合PCA,LF-NMR能有效地反應(yīng)出不同品牌黃明膠的差異,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品牌黃明膠的區(qū)分、辨識(shí)。

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