國(guó)旭丹 王超楠 張 婧 吳蘭芳

(河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1，石家莊 050200) (河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2，石家莊 050200)

苦蕎(FagopyrumtatariumGaertn.)含有豐富的酚類物質(zhì)尤其是黃酮類成分，如蘆丁和槲皮素含量和活性極為突出。實(shí)驗(yàn)研究和流行病學(xué)研究表明苦蕎黃酮在控制體重、降低血糖、血脂、血壓水平，抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和改善血管功能等方面的有益作用[4]?？寡趸允强嗍w發(fā)揮以上保健功能作用的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)地點(diǎn)、環(huán)境因素、生長(zhǎng)季節(jié)及品種會(huì)影響蕎麥的品質(zhì)指標(biāo)，但氣象因子是影響蕎麥綜合品質(zhì)指標(biāo)的最重要、最活躍的因子[5]，而氣象因子對(duì)苦蕎抗氧化性差異的貢獻(xiàn)大小卻鮮見報(bào)道。

本研究以在3個(gè)不同環(huán)境條件下生長(zhǎng)的2個(gè)品種的苦蕎為原料，通過提取苦蕎全粉中的游離酚和結(jié)合酚，并在不同的抗氧化體系考察它們的體外抗氧化性，以HPLC測(cè)定蘆丁和槲皮素的含量，進(jìn)而定量分析品種、環(huán)境條件及其交互作用對(duì)以上指標(biāo)差異貢獻(xiàn)的大小，在此基礎(chǔ)上分析以上指標(biāo)和生長(zhǎng)環(huán)境的相關(guān)性。以期初步探討通過選擇優(yōu)化特定品種和生長(zhǎng)條件培育出具有更強(qiáng)抗氧化性的苦蕎具有可能性。本研究結(jié)果為苦蕎的育種、生產(chǎn)和消費(fèi)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集生長(zhǎng)在四川涼山、寧夏同心和甘肅定西的興苦2號(hào)與迪慶苦蕎種子，3個(gè)地區(qū)的環(huán)境條件如表1。

表1 3個(gè)苦蕎生長(zhǎng)地的環(huán)境條件

DPPH·、ABTS、Trolox、β-胡蘿卜素、Tween-40、蘆丁、槲皮素標(biāo)品(色譜級(jí))。

1.2 儀器與設(shè)備

ESB-300實(shí)驗(yàn)室乳化機(jī)； UV1240紫外可見分光光度計(jì)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)；高效液相色譜儀：SPD-M10A VP Shimadzu, LC-8A pump。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理：

采用萬能粉碎機(jī)將苦蕎種子粉碎，時(shí)間約30 s，過40目篩，棄苦蕎殼，得苦蕎全粉。

1.3.2 水分的測(cè)定

將苦蕎種子97 ℃干燥16 h后，放入干燥器中冷卻，稱重，再干燥、冷卻、稱重，直至恒重，測(cè)得苦蕎種子的含水量。

1.3.3 游離酚的提取

1 g苦蕎全粉用50 mL 80%丙酮均質(zhì)10 min，1 500 r/min離心10 min，取上清。此步驟重復(fù)操作3次。收集3次上清液，于45 ℃蒸干，甲醇定容至10 mL，即為游離酚提取物。-20 ℃避光儲(chǔ)存[6]。

1.3.4 結(jié)合酚的提取

1 g苦蕎全粉以50 mL 80%丙酮均質(zhì)10 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清。沉淀部分加入20 mL 2 mol/L NaOH，充氮?dú)?，搖床上消化1 h，以4 mL濃鹽酸調(diào)至中性，20 mL正己烷去脂后，20 mL乙酸乙酯提取，離心后取上清，乙酸乙酯提取5次，合并上清45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干。甲醇定容至10 mL，即為結(jié)合酚提取物。-20 ℃避光儲(chǔ)存[6]。

1.3.5 DPPH·的清除能力

1 mL提取液與1 mL 131.87 μmol/L DPPH·溶液混勻后室溫下避光放置30 min， 517 nm處測(cè)吸光值。結(jié)果以μmol Trolox/100 g DW表示[7]。做3次重復(fù)。

1.3.6 ABTS·+的清除能力

5 mol/L ABTS溶液與二氧化錳室溫下放置30 min，過濾除去二氧化錳，734 nm下以pH 7.4的磷酸緩沖液將該溶液吸光值調(diào)至0.7得穩(wěn)定的ABTS·+溶液。3 mL ABTS·+溶液與200 μL稀釋一定倍數(shù)的提取液反應(yīng)，734 nm下測(cè)其吸收值，3 mL ABTS·+溶液與200 μL蒸餾水作對(duì)照。結(jié)果以mmol Trolox/100 gDW表示[8]。做3次重復(fù)。

1.3.7 β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液法

參照文獻(xiàn)[9]的方法?？寡趸禂?shù)(AAC)的計(jì)算公式為：

式中：As(60)為樣品管60 min時(shí)的吸光值；Ac(60)為對(duì)照管60 min時(shí)的吸光值；Ac(0)為對(duì)照管0 min時(shí)的吸光值。

1.3.8 蘆丁和槲皮素含量的測(cè)定

上清液經(jīng)0.45 μm過濾，Phenomenex C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相0.4%磷酸-甲醇(體積比40∶60)，流速1.0 mL/min，柱溫20 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)358 nm，進(jìn)樣量100 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，結(jié)果以mg/100 g DW表示。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

方差分析和顯著性檢驗(yàn)用SPSS軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎全粉的抗氧化作用

2.1.1 DPPH·清除能力

由圖1可知，游離酚和結(jié)合酚提取液均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的DPPH·清除能力，清除能力范圍分別是(22 931.81±496.80)～(33 403.68±393.55) μmol Trolox/100 g DW和(66.16±1.11)～(245.82±14.01) μmol Trolox/100 g DW，顯然游離酚提取物遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于結(jié)合酚提取物的DPPH·清除能力，這是由于苦蕎全粉中的抗氧化成分大多以游離形式存在。由圖1還可看出，不同樣品表現(xiàn)出了不同的DPPH·清除能力，這可能是由于苦蕎生長(zhǎng)的環(huán)境條件和品種的影響。例如，對(duì)于興苦2號(hào)品種，3個(gè)地區(qū)生長(zhǎng)的苦蕎全粉的結(jié)合酚提取物對(duì)DPPH·的清除能力有顯著差異。對(duì)于迪慶品種，在四川生長(zhǎng)的苦蕎全粉的游離酚和結(jié)合酚提取物的DPPH·的清除能力都明顯高于在寧夏和甘肅生長(zhǎng)的。不同品種的苦蕎在相同地域如寧夏和甘肅地區(qū)生長(zhǎng)時(shí)其對(duì)DPPH·的清除能力也具有顯著不同。

注：字母不同表示差異在P<0.05水平顯著，余同。圖1 苦蕎提取物的DPPH·的清除能力

2.1.2 ABTS·+清除能力

由圖2可知，游離酚和結(jié)合酚提取液均表現(xiàn)出較強(qiáng)的ABTS·+清除能力，清除能力范圍分別是(123.30±0.85)～(139.17±11.17)mmol Trolox/100 g DW和(0.42±0.04)～(1.01±0.10)mmol Trolox/100 g DW，顯然游離酚提取物仍遠(yuǎn)高于結(jié)合酚提取物的ABTS·+清除能力。雖然不同品種和不同環(huán)境條件下生長(zhǎng)的苦蕎全粉游離酚提取物對(duì)ABTS·+的清除能力都沒有顯著差異，但它們的結(jié)合酚提取物之間的差異顯著。

圖2 苦蕎提取物的ABTS·+的清除能力

2.1.3 抑制β-胡蘿卜素褪色的能力

由圖3可知，盡管游離酚提取物部分被稀釋了一定倍數(shù)，游離酚提取液仍表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制β-胡蘿卜素褪色的能力，其抗氧化系數(shù)范圍是(518.17±15.45)～(701.47±21.56)，結(jié)合酚提取液的抗氧化系數(shù)范圍是(178.88±8.30)～(498.82±56.74)。在抑制β-胡蘿卜素褪色的能力上，相同品種不同地區(qū)生長(zhǎng)的苦蕎全粉游離酚或結(jié)合酚提取物具有顯著差異；相同環(huán)境條件生長(zhǎng)的不同品種的苦蕎全粉游離酚或結(jié)合酚提取物也具有顯著差異。

注：同一抗氧化系數(shù)下，自由酚被稀釋了6倍。圖3 苦蕎提取物的抗氧化系數(shù)

2.2 蘆丁和槲皮素含量

由表2可知，苦蕎全粉中以游離形式存在的蘆丁和槲皮素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以結(jié)合形式存在的蘆丁和槲皮素，說明苦蕎全粉中的蘆丁和槲皮素主要以游離形式存在。蘆丁和槲皮素含量分別是(518.54±4.32)～(1 447.87±1.69) mg/100 g DW和(425.65±4.03)～(857.62±3.66) mg/100 g DW。6個(gè)樣品的蘆丁含量都有顯著差異，除甘肅地區(qū)2個(gè)品種的槲皮素含量沒有顯著差異外，寧夏和四川的槲皮素含量均有顯著差異，表明生長(zhǎng)條件或品種或者它們的相互作用都可能影響苦蕎全粉中蘆丁和槲皮素的含量。

表2 苦蕎全粉中的蘆丁和槲皮素含量/mg/100 g DW

2.3 品種和環(huán)境對(duì)苦蕎抗氧化性的影響

本實(shí)驗(yàn)中2個(gè)品種3個(gè)生長(zhǎng)地區(qū)的苦蕎全粉在不同的抗氧化體系中表現(xiàn)出了顯著差異，說明品種和環(huán)境對(duì)苦蕎抗氧化性有較大影響。為了分離并定量品種、環(huán)境和品種×環(huán)境(品種和環(huán)境交互作用)對(duì)苦蕎抗氧化性的影響，基于3個(gè)地區(qū)2個(gè)苦蕎品種的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了一個(gè)2×3因子的ANOVA分析。品種、環(huán)境和品種×環(huán)境方差貢獻(xiàn)率(總均方的百分比)的大小可以指出它們對(duì)苦蕎抗氧化性影響的相對(duì)重要性。方差貢獻(xiàn)率見表3。結(jié)果表明品種、環(huán)境和品種×環(huán)境都極顯著影響著苦蕎的DPPH·清除能力，蘆丁和槲皮素含量(P<0.01)。而對(duì)于抗氧化系數(shù)，環(huán)境對(duì)游離酚提取物總方差表現(xiàn)出了較高的貢獻(xiàn)率，達(dá)77.36%(P<0.01)，而品種×環(huán)境對(duì)結(jié)合酚提取物總方差表現(xiàn)出了較高的貢獻(xiàn)率，達(dá)77.11%(P<0.01)?？偟膩碚f，對(duì)于抗氧化性，環(huán)境貢獻(xiàn)率(范圍為40%～77%)高于品種和品種×環(huán)境的貢獻(xiàn)率(分別為31%～33%和20%～77%)；對(duì)于蘆丁和槲皮素含量，環(huán)境的貢獻(xiàn)率也高于品種和品種×環(huán)境。說明環(huán)境對(duì)抗氧化性、蘆丁和槲皮素含量的影響較品種和品種×環(huán)境大。

表3 品種、環(huán)境及交互作用對(duì)苦蕎抗氧化性影響的比例

注：結(jié)果以總均方的百分比表示；*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01)，n代表沒有貢獻(xiàn)。

2.4 抗氧化作用和生長(zhǎng)條件的關(guān)系

由2.3結(jié)果分析得到對(duì)苦蕎粉的抗氧化性的影響因素中生長(zhǎng)環(huán)境是最重要因素。所以，重點(diǎn)分析了環(huán)境參數(shù)包括平均氣溫、降水量、日照時(shí)間和海拔對(duì)苦蕎抗氧化性的影響，苦蕎粉抗氧化性與環(huán)境參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，海拔與蘆丁含量在2個(gè)品種中都表現(xiàn)出了顯著的正相關(guān)性(r=0.98，P<0.05)。對(duì)于興苦2號(hào)品種，總DPPH·清除能力與海拔有顯著的正相關(guān)性(r=0.99，P<0.05)，游離酚提取物抑制β-胡蘿卜素褪色的能力與降水量有顯著的正相關(guān)性(r=0.98，P<0.05)。對(duì)于迪慶品種，結(jié)合酚提取物抑制β-胡蘿卜素褪色的能力(r=0.99，P<0.05)和槲皮素含量(r=0.96，P<0.05)與日照時(shí)間有顯著的正相關(guān)性。

表4 苦蕎抗氧化性與生長(zhǎng)條件的相關(guān)性分析

注：結(jié)果以Pearson相關(guān)系數(shù)表示；*表示顯著(P<0.05)； DPPH代表DPPH·的清除能力， AACF代表游離酚提取物的抗氧化系數(shù)，AACB代表結(jié)合酚提取物的抗氧化系數(shù)。

3 討論

在3種抗氧化體系中，苦蕎表現(xiàn)出了很強(qiáng)的DPPH·和ABTS·+的清除能力及抑制β-胡蘿卜素褪色的能力(圖1～圖3)。DPPH·和ABTS·+的清除能力分別為2.3×104～3.3×104μmol Trolox eq./100 g DW和1.2×105～1.4×105μmol Trolox eq./100 g DW，顯然，苦蕎的自由基清除能力高于小麥(ABTS·+清除能力為14.3～17.6 μmol Trolox /g DW))[10]、強(qiáng)化的胡蘿卜(DPPH·的清除能力為6.21～ 131.1μmol Trolox/g DW、ABTS·+的清除能力為10.1～285.0μmol Trolox/g DW)[11]，暗示苦蕎可以作為清除自由基的良好膳食來源。在抑制β-胡蘿卜素褪色方面，苦蕎游離酚提取物的AAC為518～701，結(jié)合酚提取物的AAC為178～501(圖3)，與甜蕎籽、小麥胚芽、向日葵籽以及公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化性的藍(lán)莓(抗氧化系數(shù)分別為125、236、298和796)[12]相比，苦蕎的AAC較高，暗示在抑制β-胡蘿卜素褪色方面苦蕎同樣具有較高的有效性。

從圖1～圖3可看出，游離酚提取物的自由基清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于結(jié)合酚提取物。平均來說，游離酚提取物對(duì)總自由基清除能力的貢獻(xiàn)大于99%。因此，可以認(rèn)為游離酚提取物是總自由基清除能力的主要貢獻(xiàn)者?？嗍w在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域已廣受關(guān)注，黃酮成分是其功能性開發(fā)基礎(chǔ)，蘆丁和槲皮素是其中含量最為豐富，活性最為突出的黃酮化合物。本研究中苦蕎粉以游離形式存在的蘆丁和槲皮素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以結(jié)合形式存在的蘆丁和槲皮素，說明苦蕎全粉中的蘆丁和槲皮素主要以游離形式存在。由于游離酚和結(jié)合酚分別在人體的上消化道和結(jié)腸被吸收發(fā)揮它們對(duì)機(jī)體健康的保護(hù)作用，所以苦蕎粉通過上消化道被吸收發(fā)揮保健功能的作用更大。

由圖1～圖3和表2可知， 在3個(gè)地區(qū)生長(zhǎng)的2個(gè)品種的苦蕎全粉在抗氧化性、蘆丁和槲皮素的含量上均表現(xiàn)出了顯著差異，說明品種和環(huán)境對(duì)它們有較大影響。本研究進(jìn)而定量分析了品種、環(huán)境條件及其交互作用對(duì)以上指標(biāo)差異貢獻(xiàn)的大小。環(huán)境貢獻(xiàn)率最大，其次是品種×環(huán)境，品種的貢獻(xiàn)率最低。發(fā)現(xiàn)日照時(shí)間、降水量、海拔與苦蕎全粉的抗氧化性、蘆丁和槲皮素含量有顯著的正相關(guān)性，平均氣溫與槲皮素含量有顯著的負(fù)相關(guān)性，文獻(xiàn)[5]指出蕎麥整個(gè)生育期降水有利于蕎麥品質(zhì)指標(biāo)的積累，充足的光照有利于作物生長(zhǎng)，也利于各品質(zhì)指標(biāo)積累。較高的均溫和日最高溫大于30 ℃時(shí)，對(duì)蕎麥的生長(zhǎng)有不良影響，不利于各品質(zhì)指標(biāo)的積累，以上報(bào)道支持本研究結(jié)果。蘆丁含量和生長(zhǎng)地的海拔高度在2個(gè)品種中表現(xiàn)出了一致的結(jié)果，說明苦蕎全粉的蘆丁含量與其生長(zhǎng)地的海拔有顯著的相關(guān)性。文獻(xiàn)[13]發(fā)現(xiàn)環(huán)境條件比品種更能影響苦蕎藥草的蘆丁含量，而且苦蕎葉中的蘆丁含量受UV-B照射和干燥處理的影響[14]。以上說明海拔越高，紫外線越強(qiáng)，越有利于蘆丁的產(chǎn)生。所以在高海拔地區(qū)種植苦蕎有利于蘆丁含量的積累。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果指出環(huán)境對(duì)苦蕎全粉抗氧化性、蘆丁和槲皮素含量總方差的貢獻(xiàn)率最大，其次是品種×環(huán)境，品種的貢獻(xiàn)率最低。環(huán)境參數(shù)如高海拔有助于提高苦蕎蘆丁含量(r=0.98，P<0.05)，日照時(shí)間與槲皮素有顯著的正相關(guān)性(r=0.98，P<0.05)，海拔、降水量和日照時(shí)間與苦蕎全粉的抗氧化性有顯著的正相關(guān)性(r≥0.98，P<0.05)。該結(jié)果提示通過優(yōu)化特定苦蕎品種的生長(zhǎng)條件便可能培育出富含天然抗氧化劑的苦蕎。