周維，譚曉宇，李慧芬，王爽

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miR-216a-5p通過(guò)JAK2靶向抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲

周維，譚曉宇，李慧芬，王爽

200137 上海市第七人民醫(yī)院腫瘤科（周維、王爽）；510010 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肝膽外科（譚曉宇、李慧芬）

明確 miR-216a-5p 在調(diào)控肝細(xì)胞癌（HCC）中的生物學(xué)作用及其可能機(jī)制。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）方法檢測(cè) 92 例 HCC 患者的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中 miR-216a-5p 的表達(dá)情況。并采用 CCK8 和 Transwell 試驗(yàn)檢測(cè) miR-216a-5p 對(duì) HCC 細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。采用熒光素酶、蛋白質(zhì)印跡和 qRT-PCR 檢測(cè)肝細(xì)胞癌中 miR-216a-5p 的表達(dá)與 JAK2 表達(dá)的相關(guān)性。

發(fā)現(xiàn) miR-216a-5p 在 HCC 中的表達(dá)顯著降低，并與多種臨床病理特征（腫瘤多樣性、組織學(xué)分化、巴塞羅那分期）相關(guān)。低表達(dá) miR-216a-5p 的 HCC 患者預(yù)后不良。雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)分析證實(shí) JAK2 是miR-216a-5p 的直接下游靶基因。并且過(guò)表達(dá) JAK2 抵消了 miR-216a-5p對(duì) HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制能力。

miR-216a-5p 可能是一種新的潛在的肝癌治療靶點(diǎn)。

癌，肝細(xì)胞； Janus 激酶2； 細(xì)胞增殖； 腫瘤侵潤(rùn)； miR-216a-5p

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。目前，雖然在 HCC 的治療方面已經(jīng)取得了很大的成就，但 HCC 患者的預(yù)后仍然不令人滿(mǎn)意[2-3]。以往的研究報(bào)道表明腫瘤抑制因子的失活和信號(hào)路徑的異常調(diào)控與 HCC 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，但是其背后的機(jī)制作用仍有待闡明。

microRNAs（miRNAs）是一類(lèi)高度保守的小分子 RNAs，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。miRNA 通過(guò)結(jié)合靶向 mRNA 序列的 3' 非編碼區(qū)域（UTRs）來(lái)對(duì)其進(jìn)行翻譯抑制，從而參與多種病理過(guò)程[4]。研究表明，多種 miRNAs 作為癌基因或腫瘤抑制因子參與了細(xì)胞的癌變并發(fā)揮重要作用[5]。例如：miR-233 通過(guò)mTOR 信號(hào)路徑抑制 HCC 的形成、促進(jìn) HCC 凋亡[6]；miR-487a 通過(guò)結(jié)合 PIK3R1 和 SPRED2 促進(jìn) HCC 的增殖和轉(zhuǎn)移[7]。然而，miR-216a-5p 在 HCC 中的生物學(xué)作用和分子機(jī)制還需進(jìn)一步明確。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) miR-216a-5p 異常低表達(dá)與 HCC 患者的臨床病理特征和預(yù)后顯著相關(guān)。miR-216a-5p 可通過(guò)直接結(jié)合 Janus 激酶 2（JAK2）調(diào)控 HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系 HepG2（貨號(hào)：CBP60199）、Hep3B（貨號(hào)：CBP60197）、MHCC-LM3（貨號(hào)：CBP60654）、SMMC7721（貨號(hào)：CBP60210）及人肝癌癌旁細(xì)胞系 QSG-7701（貨號(hào)：CBP61056）和 HEK-293T（貨號(hào)：CBP60439）細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 患者及肝癌組織樣本 在廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院進(jìn)行肝切除術(shù)的 HCC 患者中獲得了共計(jì) 92 對(duì)匹配的新鮮 HCC 組織標(biāo)本和相鄰的癌旁組織樣本。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療或化療。所有患者均知情同意且本研究得到廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院倫理道德委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有的細(xì)胞用含有 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為 5% 的溫箱中培養(yǎng)，每 2 ~ 3 天更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2 RNA 的提取及實(shí)時(shí)定量 PCR（qRT-PCR） 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[8]，GAPDH 和 U6 分別作為 mRNA 和 miRNA 的內(nèi)參，U6 為內(nèi)參基因。引物如下：JAK2：5' GGG AGGTGGTCGCTGTAAAA 3'（上游），5' ACCAGC ACTGTAGCACACTC 3'（下游）；GAPDH：5' TGTG GGCATCAATGGATTTGG 3'（上游）；5' ACACCA TGTATTCCGGGTCAAT 3'（下游）。用 2-??Ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 慢病毒和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 的慢病毒及對(duì)照物，過(guò)表達(dá) JAK2 慢病毒和對(duì)照物均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 通過(guò) CCK8 實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞增殖能力。以每孔 103個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種于 96 孔板中孵育 1、2、3、4、5 d。具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[8]，該實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.5 細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn) 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[8]，每室選取 5 個(gè)隨機(jī)觀察視野進(jìn)行分析。

1.2.6 蛋白印跡試驗(yàn) 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[8]，文中所用抗體 JAK2（ab32060）、STAT3 p-STAT3（ab32539）和 GAPDH（ab8245）。

1.2.7 熒光素酶試驗(yàn) 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[8]和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，文中報(bào)告基因購(gòu)自上海吉馬生物制藥有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料兩組或兩組以上采用 Student檢測(cè)或 One-way ANOVA 分析；肝細(xì)胞癌組織中 miRNA 的表達(dá)與臨床參數(shù)關(guān)系的比較采用2檢驗(yàn)和 Fisher's exact test 分析；Kaplan-Meier 生存曲線(xiàn)采用 Log-rank 檢驗(yàn)，分析 miRNA 與肝癌患者的臨床預(yù)后。< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-216a-5p 在 HCC 組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)

通過(guò) qRT-PCR 對(duì) 92 對(duì) HCC 和匹配的癌旁組織中 miR-216a-5p 的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。HCC 以 U6 為內(nèi)參基因，miR-216a-5p 在 HCC 組織中的相對(duì)表達(dá)為 1.108 ± 0.061，匹配的癌旁組織中表達(dá)為 1.349 ± 0.081，對(duì)應(yīng)的癌旁組織 miR-216a-5p 的表達(dá)顯著降低（圖 1A，= 0.018）。表 1 中顯示了 92 例 HCC 患者中 miR-216a-5p 表達(dá)量與臨床病理特征之間的關(guān)系，以 miR-216a-5p 在92 例肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為界，將患者分為低表達(dá)組（n = 45）、高表達(dá)（n = 47）兩組，低表達(dá)的 miR-216a-5p 的表達(dá)水平與腫瘤的數(shù)目（< 0.001），組織分化（= 0.002）及巴塞羅那分期（BCLC）（< 0.001）顯著相關(guān)。根據(jù)病理組織分化程度將患者分為低分化和中/高分化兩組，低分化組的 miR-216a-5p 相對(duì)表達(dá)為 0.970 ± 0.090，中/高分化組的 miR-216a-5p 相對(duì)表達(dá)為1.234 ± 0.080，結(jié)果提示低分化組的 miR-216a-5p 的相對(duì)表達(dá)低于中/高分化組的 miR-216a-5p 相對(duì)表達(dá)（圖 1B，= 0.031）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BCLC 0/A 分期患者腫瘤組織中 miR-216a-5p 相對(duì)表達(dá)為 1.219 ± 0.074，BCLC B 分期患者的 miR-216a-5p 相對(duì)表達(dá)為 0.950 ± 0.103，以上結(jié)果提示與 BCLC 0/A 分期患者相比，BCLC B 分期患者水平腫瘤組織 miR-216a-5p 表達(dá)相對(duì)較低（圖 1C，= 0.030）。接下來(lái)，我們檢測(cè) miR-216a-5p 在 4 株 HCC 細(xì)胞系（HepG2、Hep3B、MHCC-LM3 和 SMMC7721）和 1 株人肝癌癌旁細(xì)胞系 QSG7701 中的 miR-216a-5p 表達(dá)水平，依次為 0.481 ± 0.032、0.356 ± 0.033、0.273 ± 0.034、0.161 ± 0.024 和 1.000 ± 0.023。該結(jié)果提示與組織樣本的表達(dá)趨勢(shì)一致，miR-216a-5p 在所有 4 株 HCC 細(xì)胞系中的表達(dá)水平均有所下降（圖 1D，< 0.001）。

圖 1 miR-216a-5p 在 HCC 組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)（A：qRT-PCR 檢測(cè)了 92 對(duì) HCC 組織和癌旁組織中 miR-216a-5p 的表達(dá)；B：在組織學(xué)分化較差的患者中，miR-216a-5p 表達(dá)水平較低；C：BCLC B 分期組 miR-216a-5p 的表達(dá)低于 BCLC 0/A 分期組；D：qRT-PCR 檢測(cè) HCC 細(xì)胞系和肝癌癌旁細(xì)胞系中 miR-216a-5p 的表達(dá)；*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 1 The expression of miR-216a-5p was significantly decreased in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and HCC cell lines (A: The expression of miR-216a-5p in 92 pairs of HCC and peritumor tissues was examined by qRT-PCR; B: A lower expression level of miR-216a-5p was observed in patients with poor histological differentiation; C: The level of miR-216a-5p was lower in the BCLC B stage group than in the BCLC 0/A stage group; D: The level of miR-216a-5p in HCC cell lines and normal liver cell line was investigated;*< 0.05,***< 0.001)

2.2 miR-216a-5p 的低表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良

進(jìn)一步評(píng)估了 miR-216a-5p 異常表達(dá)對(duì) HCC 患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的miR-216a-5p 患者總體存活率低于高表達(dá)的 miR-216a-5p 患者（圖 2A，< 0.001）。此外，miR-216a-5p 表達(dá)降低也有較高的復(fù)發(fā)概率（圖 2B，< 0.001）。這些結(jié)果表明，miR-216a-5p 異常降低可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

表 1 miR-216a-5p 表達(dá)水平與 HCC 臨床病理特征的相關(guān)性

注：*< 0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Note:*< 0.05 was considered to be statistically significance.

圖 2 Kaplan-Meier 分析 miR-216a-5p 表達(dá)與 HCC 患者預(yù)后的關(guān)系（P < 0.001）

Figure 2 Kaplan-Meier analysis of the relationship between miR-216a-5p expression and HCC prognosis (< 0.001)

2.3 過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 抑制 HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

為了評(píng)估 miR-216a-5p 在 HCC 細(xì)胞中的生物學(xué)功能，將構(gòu)建好的 miR-216a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染至 MHCC-LM3 和 SMMC7721 細(xì)胞中。如圖 3A，qRT-PCR 結(jié)果證實(shí) miR-216a-5p 的表達(dá)水平在 MHCC-LM3-miR-216a-5p 組是 MHCC-LM3 對(duì)照組的 5.936 倍（< 0.001）；SMMC7721-miR- 216a-5p 組是 SMMC7721 對(duì)照組的 6.143 倍（< 0.001）；miR-216a-5p 組中 miR-216a-5p 的表達(dá)水平高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果證明 miR-216a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染成功。

CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示，MHCC-LM3-miR- 216a-5p 組細(xì)胞的增殖能力從第 2 天開(kāi)始明顯低于MHCC-LM3 對(duì)照組（圖 3B，< 0.05）；SMMC7721-miR-216a-5p 組細(xì)胞的增殖能力從第 3 天開(kāi)始明顯低于 SMMC7721 對(duì)照組（圖 3C，< 0.05）。

接下來(lái)我們用 Transwell 實(shí)驗(yàn)研究了 miR- 216a-5p 對(duì) HCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。在遷移實(shí)驗(yàn)中，MHCC-LM3 對(duì)照組與 MHCC-LM3- miR-216a-5p 組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)量比值為 2.881，SMMC7721 對(duì)照組與 SMMC7721-miR-216a-5p 組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)量比值為 2.596。結(jié)果顯示與MHCC-LM3 和 SMMC7721 的對(duì)照組相比，在 MHCC-LM3 和 SMMC7721 的 miR-216a-5p 組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3D，< 0.001）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，MHCC-LM3 對(duì)照組與 MHCC-LM3-miR-216a-5p 組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)量比值為 2.674，SMMC7721 對(duì)照組與 SMMC7721-miR-216a-5p 組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)量比值為 2.208。結(jié)果顯示與 MHCC-LM3 和 SMMC7721 的對(duì)照組相比，在 MHCC-LM3 和 SMMC7721 的 miR-216a-5p 組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3D，< 0.001）。這些結(jié)果表明，miR-216a-5p 可以顯著抑制 HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

2.4 JAK2 是 miR-216a-5p 的直接靶基因

為了探討 miR-216a-5p 對(duì) HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲影響的潛在機(jī)制，我們采用了在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件（http://www.targetscan.org/vert_72/）。預(yù)測(cè)結(jié)果提示 miR-216a-5p 可以與 JAK2 的 3'-UTR 結(jié)合（圖 4A）。JAK2 參與了癌癥的發(fā)展過(guò)程[9]，之前有報(bào)道稱(chēng)它是多種 miRNAs 的直接靶點(diǎn)[10-12]。為了研究 JAK2 是否是 miR-216a-5p 的直接靶點(diǎn)，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)。在 HEK293T 細(xì)胞中將 miR-216a-5p 模擬物和 JAK2 3'-UTR 熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示在對(duì)照組細(xì)胞中 JAK2 3'-UTR 熒光素酶相對(duì)活性為 1.000 ± 0.087，在 miR-216a-5p 組細(xì)胞中 JAK2 3'-UTR 熒光素酶相對(duì)活性 0.317 ± 0.018，證實(shí)過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 顯著降低了 JAK2 3'-UTR 熒光素酶活性（圖 4B，< 0.01）；在對(duì)照組細(xì)胞中JAK2 3'-UTR-mut 熒光素酶相對(duì)活性為 1.000 ± 0.052，在 miR-216a-5p 組細(xì)胞中 JAK2 3'-UTR-mut 熒光素酶相對(duì)活性 1.127 ± 0.044，證實(shí)過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 對(duì) JAK2 3'-UTR-mut 熒光素酶活性沒(méi)有影響（圖 4B，> 0.05）。qRT-PCR 結(jié)果證實(shí) JAK2 的 mRNA 表達(dá)水平在 MHCC-LM3 對(duì)照組是MHCC-LM3-miR- 216a-5p 組的 3.816 倍（圖 4C，< 0.01）；SMMC7721 對(duì)照組是SMMC7721-miR-216a-5p 組的 3.315 倍（圖 4C，< 0.01）；miR-216a-5p 組中 JAK2 的 mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]到JAK2 是 JAK2/STAT3 信號(hào)通路中重要的調(diào)控因子，我們接下來(lái)檢測(cè)了這個(gè)信號(hào)通路是否參與了 miR-216a-5p 相關(guān)的 HCC 進(jìn)展。Western blot 結(jié)果顯示過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 的 MHCC-LM3 和 SMMC7721 細(xì)胞中 JAK2 和p-STAT3 蛋白水平呈降低趨勢(shì)（圖 4D）。以上結(jié)果表明 JAK2 是 miR-216a-5p 的直接靶基因。

圖 3 過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 抑制 HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（A：細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-216a-5p 模擬物后 qRT-PCR 檢測(cè) miR-216a-5p 的表達(dá)水平；B：CCK8 試驗(yàn)檢測(cè) MHCC-LM3 細(xì)胞的增殖能力；C：CCK8 試驗(yàn)檢測(cè)SMMC7721 細(xì)胞的增殖能力；D：Transwell 試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力；*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 3 Overexpression of miR-216a-5p inhibited HCC cells proliferation, migration, and invasion (A: The transfection of lentivirus- overexpressing miR-216a-5p increased the expression of miR-216a-5p in HCC cells by qRT-PCR; B and C: CCK8 assays were performed to measure the HCC cell viability; D: The HCC cells migration and invasion, as detected by Transwell assays;*< 0.05,***< 0.001)

圖 4 JAK2 為 miR-216a-5p 直接靶點(diǎn)（A：miR-216a-5p 與 JAK2 的 3'-UTR 中的結(jié)合序列；B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miR-216a-5p 與 JAK2 的 3'-UTR 結(jié)合情況；C：qRT-PCR 分析各組細(xì)胞中 JAK2 的 mRNA 表達(dá)；D：Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中 JAK2 和 p-STAT3 的蛋白表達(dá)；**P < 0.01）

Figure 4 JAK2 was a direct target gene of miR-216a-5p (A: The putative binding sequence of miR-216a-5p in the 3'-UTR of JAK2; B: The dual luciferase reporter assay showed that miR-216a-5p bound to the 3'-UTR of JAK2; C: qRT-PCR analysis of JAK2 mRNA expression in HCC cells; D: The protein level of JAK2 and p-STAT3 in HCC cells was analysis by Western blot;**< 0.01)

2.5 miR-216a-5p 通過(guò)調(diào)控 JAK2 表達(dá)抑制 HCC 增殖、遷移和侵襲

接下來(lái)，我們研究 miR-216a-5p 是否通過(guò)調(diào)控 JAK2 表達(dá)來(lái)抑制 HCC 增殖、遷移和侵襲。用過(guò)表達(dá) JAK2 的慢病毒轉(zhuǎn)染至上調(diào) miR-216a-5p 的 SMMC7721 細(xì)胞中。通過(guò) Western blot 檢測(cè) JAK2 的表達(dá)情況。JAK2 上調(diào)可導(dǎo)致過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 的 SMMC7721 細(xì)胞中 p-STAT3 水平升高（圖 5A）。CCK8 實(shí)驗(yàn)和 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JAK2 升高抵消了 miR-216a-5p 對(duì) SMMC7721 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲抑制的能力（圖 5B 和 C）。以上這些研究結(jié)果證實(shí)，JAK2 在 miR-216a-5p 抑制 HCC 增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

研究證據(jù)表明，多種 miRNAs 參與了 HCC 的發(fā)展過(guò)程[8, 13]。在本研究中，我們對(duì) miR-216a-5p 異常表達(dá)與 HCC 的關(guān)系進(jìn)行闡明。研究結(jié)果顯示，HCC 組織中 miR-216a-5p 的表達(dá)明顯低于癌旁組織。在 5 株 HCC 細(xì)胞系中，miR-216a-5p 表達(dá)下調(diào)。提示異常表達(dá)的 miR-216a-5p 可能在肝癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用。接下來(lái)臨床數(shù)據(jù)分析提示 miR-216a-5p 低表達(dá)與腫瘤數(shù)目、組織學(xué)分化和 BCLC 分期有顯著的相關(guān)性。miR-216a-5p 表達(dá)水平的降低預(yù)示了肝癌患者的不良預(yù)后。以上結(jié)果提示 miR-216a-5p 可能與肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。為了證明這一點(diǎn)，我們將 miR-216a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染至 MHCC-LM3 和 SMMC7721 細(xì)胞系后檢測(cè)其增殖、遷移和轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 能明顯抑制 MHCC-LM3 和 SMMC7721 細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力。本研究首先從臨床分析中得到 miR-216a-5p 低表達(dá)與多種臨床惡性指標(biāo)相關(guān)，并且體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抑制增殖、遷移和轉(zhuǎn)移作用。提示 miR-216a-5p 在 HCC 中作為腫瘤抑制因子的重要作用。

圖 5 miR-216a-5p 通過(guò)調(diào)控 JAK2 表達(dá)抑制 HCC 增殖、遷移和侵襲（A：使用 Western blot 檢測(cè)了在過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 的SMMC7721 細(xì)胞中 JAK2 和 p-STAT3 的表達(dá)水平；B：采用 CCK8 試驗(yàn)評(píng)估 JAK2 表達(dá)上調(diào)對(duì)過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 的 SMMC7721 細(xì)胞增殖的影響；C：采用 Transwell 方法檢測(cè)了 JAK2 上調(diào)時(shí)對(duì)過(guò)表達(dá) miR-216a-5p 的 SMMC7721 細(xì)胞遷移和侵襲的影響；所得數(shù)據(jù)以 的形式顯示，***P < 0.001）

為了闡明 miR-216a-5p 在 HCC 進(jìn)展中的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-216a-5p 可以靶向 JAK2 中的 3'UTR。雙熒光素酶檢測(cè)證實(shí) JAK2 是 miR-216a-5p 的直接下游靶點(diǎn)。此外，過(guò)表達(dá) JAK2 可抵消 miR-216a-5p 抑制細(xì)胞增殖和侵襲的能力，也進(jìn)一步提示 miR-216a-5p 通過(guò) JAK2 抑制 HCC 的發(fā)展。JAK2 是 Janus 家族的非受體蛋白酪氨酸激酶成員，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)路徑調(diào)控多個(gè)細(xì)胞的演變進(jìn)程[14]。JAK2 可作為一種致癌基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和藥物耐受。在骨髓增生性白血病中，JAK2 可在正常和病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞的增殖和分化[15]。STAT3 磷酸化與 p53 突變和患者存活率息息相關(guān)。p53 功能的喪失可激活 JAK2 信號(hào)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)胰腺癌對(duì)吉西他濱的耐藥性[16]。在本研究中，JAK2 被證實(shí)是 HCC 中miR-216a-5p 的直接靶點(diǎn)。此外，我們還發(fā)現(xiàn) miR-216a-5p 與 HCC 中 JAK2/STAT3 信號(hào)路徑的失調(diào)有關(guān)。JAK2/STAT3 信號(hào)通路在腫瘤進(jìn)展、遷移和血管生成中起著重要的作用。其中 JAK2/STAT3 通過(guò)細(xì)胞外生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核。Wang 等[17]的研究表明，lnc-BM 和 JAK2 通過(guò)激活 lnc-BM/JAK2/STAT3 通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，結(jié)直腸癌來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò) IL-6/JAK2/STAT3 信號(hào)通路增加癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[18]。我們的研究結(jié)果顯示 JAK2/STAT3 信號(hào)通路在 HCC 進(jìn)展中受到 miR-216a-5p 的調(diào)控。

綜上所述，本研究證實(shí)在 HCC 中 miR-216a-5p 下調(diào)，且通過(guò) JAK2/STAT3 信號(hào)通路抑制了 HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。低表達(dá)水平的 miR-216a-5p 預(yù)示了不良預(yù)后。以上發(fā)現(xiàn)可能為 HCC 治療提供新的治療思路。

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miR-216a-5p suppresses the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells through targeting JAK2

ZHOU Wei, TAN Xiao-yu, LI Hui-fen, WANG Shuang

Department of Oncology, The Shanghai Seventh People’s Hospital, Shanghai 200137, China (ZHOU Wei, WANG Shuang); Department of Hepatobiliary Surgery, General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangdong 510010, China (TAN Xiao-yu, LI Hui-fen)

Accumulating evidences have indicated that microRNA (miRNA) dysregulation contributes to hepatocellular carcinoma (HCC) progression. In this study, we investigated the potential function of miR-216a-5p in HCC.

Expression of miR-216a-5p in 92 cases of HCC tissues and adjacent normal tissues was determined by using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analyses. In vitro, cell proliferation and invasion capacity were evaluated by CCK8 assay and Transwell invasion assay, respectively. Luciferase reporter assay, Western blot and qRT-PCR were used to detect the association between miR-216a-5p expression and Janus kinase 2 (JAK2) in HCC.

In this study, we showed that the expression level of miR-216a-5p was significantly decreased in HCC, and was associated with several clinicopathological characteristics, including tumor multiplicity, histological differentiation, and Barcelona clinic liver cancer stage. Low expression level of miR-216a-5p was associated with poor survival outcomes in HCC patients. Upregulation of miR-216a-5p suppressed cell proliferation, migration, and invasion of HCC. Dual luciferase assay demonstrated that JAK2 was a direct downstream target of miR-216a-5p. JAK2 reintroduction restored the inhibited proliferation, migration, and invasion of miR-216a-5p-overexpressed HCC cells. miR-216a-5p functioned as a tumor suppressor to modulate the JAK2/STAT3 signaling pathway.

The present findings indicate that miR-216a-5p could be used as a prognostic predictor and therapeutic candidate for HCC.

Carcinoma, hepatocellular; Janus kinase 2; Cell proliferation; Neoplasm invasiveness; miR-216a-5p

WANG Shuang,Email: xiaowangshuanggege@163.com

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)青年基金（20164Y0055）

王爽，Email：xiaowangshuanggege@163.com

2018-11-09

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.009